人生沒有用不到的經歷

最近低劑量電腦斷層(Low dose computed tomography, LDCT)診斷早期肺癌惹議：台灣淪全球「肺葉切除王國」的慘痛鬧劇
https://www.upmedia.mg/tw/commentary/culture-and-education/253786

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今年10月22日在Nature有一篇文章
SARS-CoV-2 mRNA vaccines sensitize tumours to immune checkpoint blockade
https://www.nature.com/articles/s41586-025-09655-y
這篇文章是回溯性的統計分析，比較「疫情前」與「疫情期間有注射新冠疫苗」的肺癌病人，使用Anti-PD-1或Anti-PD-L1治療的差異，40個月的存活率從25%提升至50%。免疫學的難懂處有如量子力學，費曼有一句名言：「I think I can safely say that nobody understands quantum mechanics.」拿到免疫學也適用。
當外來抗原入侵人體，Dendritic cell(APC)吞食外來抗原後，T cell活化前，會經過一道篩選過程，避免Autoimmune T cell活化，如下圖：
   
圖一：如果TCR偵測到MHC呈現的是Non-self antigen，T cell會啟動B7-CD28的刺激訊息，活化而分裂；如果TCR偵測到MHC呈現的是Self or self-like antigen，T cell 會啟動PD-1-PD-L1的抑制訊息，T cell就會停止活化。B7的另一名稱是CD80/86。Immune checkpoint blockers就是用Anti-PD-1或Anti-PD-L1 antibody重新活化被抑制的T cell，副作用是可能誘發自體免疫疾病。
癌細胞由DNA突變導致突變蛋白的Peptide被MHC-I呈現出來，如果被CD8⁺ T cell(CTL)辨識為Non-self antigen，CTL就會殺死該癌細胞。99.999---%的癌細胞被CTL發現後就會立即被摧毀。如果癌細胞已長成數十個或數百個，就會啟動如下的抗癌免疫機制：
 
https://www.nature.com/articles/s41388-021-01946-8
圖二：某種CD8⁺ T cell辨識Tumor antigen X為Non-self antigen，便會殺死癌細胞。Dendritic cell(DC)吞食死亡的癌細胞，將蛋白分解處理(ⓐ)，回到局部淋巴組織，把Tumor antigen Y呈現給另一種CD8⁺ T cell，把Tumor antigen Z呈現給一種CD4⁺ T cell；X、Y、Z是不同的Tumor antigen，由九個胺基酸組成的小Peptide。①---->② ---->③形成一個相互刺激的循環。CD4⁺ T cell會分化成Th1/Th2/Treg，Th1會分泌IL-2促使各種T cell分裂，向癌細胞移動，把癌細胞包圍起來，如下圖：
 
圖三：0.06公分的乳癌組織被免疫細胞(T cell、B cell、NK cell、Dendritic cell、Macrophage)包圍，Treg及Macrophage分泌TGF-b吸引Fibroblast過來分裂並產生Type I collagen將癌細胞包圍起來，使其缺乏養分供應而死亡(中心處有潰爛死亡的空洞)。99.99%以上的癌細胞一形成就直接被CD8⁺ T cell殺死。當數十個或數百個癌細胞長出來就會如上圖被困死，直到有一天，癌細胞經過無數次突變後不斷突破圍困，終於篩選出一個癌細胞Q，不像圖二中的癌細胞，Tumor antigens X、Y、Z可被T cell辨識成Non-self antigen；Tumor antigen Q無法被T cell辨識成Non-self antigen，這個癌細胞就會逃過免疫監控擴散出去。
有一種情況，當圖二中的Tumor antigen X或Y所對應的CD8⁺ T cell會去殺死癌細胞，但也會攻擊自己的細胞(如b-islet cell)，這樣的CD8⁺ T cell就會被Treg抑制，如下圖：
    
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36917950/

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圖一：這篇再放上111年台灣男女性十大癌症標準化發生率，乳癌遙遙領先，主因出在「多不飽和脂肪酸」的過氧化作用。
許多醫師推薦EPA、DHA等保健藥物，說有顧心、顧腦、顧眼、抗發炎等功能，其實幾乎都是白花錢。
 
圖二：a-linolenic acid、EPA、DHA的結構。EPA與DHA是由a-linolenic acid合成，三者皆為「多不飽和脂肪酸」。

EPA與DHA佔細胞各種「膜」約3-5%，需要量不大。人類每天吃下1.5克a-linolenic acid會自動合成約150毫克EPA與75毫克DHA，這是人體每日的需求量。
人類的多不飽和脂肪酸分為兩大類，在人體分別由食物中的linoleic acid與a-linolenic acid合成。
 
圖二：多不飽和脂肪酸的合成。
多不飽和脂肪酸的用處在增加「膜」的流動性(即柔軟度)，大約佔「膜」脂肪酸的30%。「膜」的流動性也可經由膽固醇來達成，膽固醇佔「膜」脂質約25%。另外45%則由飽和脂肪酸(Stearic acid與Palmitic acid)及Oleic acid來填補。吃EPA及DHA降膽固醇的機轉在減少「膜」對膽固醇的需求量，因此肝臟就不必合成那麼多膽固醇。下圖是市面上的EPA及DHA劑量：
 
圖三：市售魚油一粒中EPA及DHA的劑量，EPA 680 mg，DHA 250 mg，每天吃一粒遠遠超過每日需求量(EPA 150 mg, DHA 75 mg)。
下面廣告中的魚油一粒劑量 EPA 576 mg，DHA 384 mg。
https://www.facebook.com/reel/1729477847931420?locale=zh_TW
多不飽和脂肪酸與膽固醇在各種「膜」有一定的佔比，兩種脂質與「膜」上蛋白的訊息傳遞有關，刻意服用高濃度魚油會降低細胞膜上的膽固醇，因而降低膽固醇參與的訊息傳遞，如下圖：
 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286741631011X
圖四：Sonic hedgehog(SHH)---↓Patched(PTCH)---↓Smoothed(SMO)。當Sonic hedgehog與Patched結合時，Smoothed的抑制消除；Smoothed蛋白需要膽固醇(Cholesterol)來活化才能與SUFU結合，抑制細胞生長的訊息傳遞。這個訊息傳遞有點奇特，如下圖五。
           
圖五：A:當沒有SHH抑制PTCH1，PTCH1就會抑制SMO，PK1/PKA/GSK3會把GLIFL磷酸化，KIF7/SUFU/GLIFL-(P)會促使GLiRepressor抑制細胞生長的基因表現。
B:當SHH抑制PTCH1時，SMO經膽固醇活化後與SUFU結合，促使KIF7/SUFU/GLIFL活化GLI1/2讓細胞生長的基因表現。SHH-PTCH1-SMO-GLI1/2 pathway主要參與全身幹細胞分化，包括皮膚、呼吸系統、消化系統、造血系統、神經系統、泌尿生殖系統。
 
圖六：各種脂肪酸。Steric acid、Palmitic acid 是飽和脂肪酸，非常穩定，Oleic acid只有一個雙鍵，相對穩定，這三種脂肪酸在細胞老化死亡後都可以再利用。其它脂肪酸是多不飽和脂肪酸，當細胞老化死亡後需要活化NADPH oxidase產生Reactive oxygen species(O₂・)或活化Nitric oxide synthase產生Reactive nitrogen species(ONOO^-及NO₂^-)來將其裂解。
 
圖七：NADPH oxidase

 
圖八：Nitric oxide synthase。EPA與DHA活化Nitric oxide synthase是雙面刃，如上圖，ONOO^-與NO2^-是自由基，可裂解EPA與DHA，但自由基外溢會打斷DNA；S-GSNO是由Glutathione所攜帶的NO，NO可抑制血小板凝集及強化血管內皮細胞的功能，對心臟及大腦血管有助益。

 
圖九：多不飽和脂肪酸的裂解需吸收自由基。RONS:reactive oxygen/nitrogen species。Antioxidants種類繁多，主要是Glutathione pathway、Vitamin E、Vitamin C。
女性乳癌之所以是發生率最高的癌症，每次月經週期10⁹個乳腺細胞增生死亡是關鍵。死亡細胞殘渣各種膜上的多不飽和脂肪酸會誘導NADPH oxidase及Nitric oxide synthase產生自由基裂解這些脂肪酸，沒被Antioxidants清除的外溢自由基會造成DNA double strand break，天生修補DNA有缺陷的人就容易罹患乳癌。肺癌也一樣，肺臟Type II alveolar cell會分泌含有磷脂的界面活性劑(Surfactant)降低表面張力，防止肺泡塌陷。吃下去的脂肪酸會影響肺泡Surfactant磷脂中的脂肪酸成分。吃過多的EPA與DHA也會使EPA/DHA成為肺泡細胞膜及細胞間隙的脂肪酸主要成分，不但會吸收空汙中的自由基，當肺泡細胞老化死亡，EPA與DHA也會誘導NADPH oxidase及Nitric oxide synthase產生自由基將其裂解。

 
圖十：Type I pneumocyte(alveolar cell)負責氣體交換；Type II pneumocyte分泌含有磷脂的界面活性劑(Surfactant)。

現代人的飲食不缺linoleic acid與a-linoleinc acid，人體需要多少EPA與DHA，就會合成多少EPA與DHA。吃魚油補東牆反而挖了一個癌症的西牆。女性乳癌是肺癌的2.4倍，原因是肺臟的外溢自由基可從痰液咳出去，乳房的外溢自由基只能燜在裡面。

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最近許多名人罹患肺癌，有人因而死亡，在網路引發熱議。
 
圖一：111年台灣男女性十大癌症標準化發生率，其中女性的乳癌發生率最高，是肺癌的2.3倍，大腸癌的2.7倍。幾乎所有的醫師對癌症的發生都存在錯誤的觀念，例如把不抽菸的女性罹患肺癌歸咎於二手菸及空污。

 
圖二：免疫細胞分解死亡的細胞產生自由基(·NO，·O₂^-，ONOO^-)。
 
圖三：人體內生性自由基的產生與清除。GSH:glutathione; GPx:glutathione peroxidase; GR:glutathione reductase。
女性乳癌發生率高於肺癌與大腸癌的原因在女性每次月經週期約有10⁹個乳腺細胞增生-死亡，死亡的細胞就地被免疫細胞吞食分解，此過程會產生自由基(Free radicals)，通常會有一系列的酶將自由基清除(圖三)，但即使99.99%被清除，仍有漏網之魚。自由基會造成DNA斷裂及鹼基之間的Cross link，在修補過程中會引發突變。乳房是封閉的組織，沒被清除的自由基無法像痰液可經由呼吸道咳出，也無法像消化道經由糞便排出，唯一的排出方式便是泌乳，但現代女性很少在三十歲以前生育，導致乳癌成為發生率最高的癌症。
關於DNA的修補，請參考下面的文章(腫瘤生物13-19)：
https://wleemc.pixnet.net/blog/category/list/3409387
版主點出大部分醫師及衛福部網站的錯誤觀念：
99.9%以上的DNA突變是自發性的，吸入或吃入的東西，除非刻意大量吸入(如抽菸)或刻意大量吃入(如每天吃過量的魚油)，否則對DNA突變影響不大。
自發性突變的來源如下
i)DNA鹼基的Deamination(去胺化)
 
圖四：DNA鹼基的Deamination(-NH2--->=O)，每分每秒都在染色體32億對鹼基上發生，是DNA突變的大宗。
Deamination的鹼基會被一系列的酶切除、修補，此過程稱為Base excision repair(BER)。人活得越老，突變累積越多，BER的修復能力(各種酶的活性)決定最終的突變數量。
ii)人體每天約有10¹⁰-10¹¹個細胞死亡，各種「生物膜(membrane)」，包括胞膜、核膜、內質網、粒線體、高基氏體的主體是脂肪酸，不飽和脂肪酸佔50-80%，經由老化而分解會產生自由基，自由基會引發DNA single strand break(SSB)及Double strand break(DSB)。SSB經由Base excision repair(上述的BER)。DSB在有分裂能力的細胞靠精準的Homologous recombination(HR)修補，在沒有分裂能力的細胞靠不精準的Non-homologous end joining(NHEJ)修補。NHEJ會造成不可避免的突變。HR是由一系列的酶組成，其修補能力也決定年齡增長的突變累積量，例如先天BRCA1有缺陷的女性在40歲以前就會罹患乳癌。

 
圖五：DNA doouble strand break(DSB)與single strand break(SSB)
各種生物膜上的飽和與不飽和脂肪酸最好維持1:1，許多人為了降膽固醇，拼命吃魚油，又誤信EPA與DHA對心臟與大腦的好處，於是胞膜上的不飽和脂肪酸過多(>70%)，當細胞死亡後，胞膜上的不飽和脂肪酸分解(Lipid peroxidation)產生的自由基超過人體能清除的範圍(圖三)，於是就造成過多的DNA SSB與DSB。
 
圖六：不飽和脂肪酸的過氧化作用(Lipid peroxidation)。「·OH」來自細胞代謝或空氣中的油煙，如果來自細胞代謝，可經由圖三清除；如果來自油煙，那麼肺泡細胞膜上不飽和脂肪酸比例越高，吸收「·OH」的量就越大，這會強迫吸入的O₂參與自由基的代謝，增加圖三各種酶化解Lipid hydroperoxide的負擔。如果肺泡組織中的不飽和脂肪酸適中(50%)，油煙中的「·OH」大可被痰液包住咳出去。

 
圖七：DNA interstrand crosslink與 intrastrand crosslink
Lipid peroxidation產生的自由基也會造成DNA interstrand crosslink與 intrastrand crosslink(圖七)。Interstrand crosslink靠HR及NHEJ修補，Intrastrand crosslink靠Nucleotide excision repair(NER)。NHEJ容易產生突變，NER的酶系的活性也與突變累積量有關。

 
 圖八：具備分裂能力的細胞的細胞週期(Cell cycle)。
iii)DNA複製時不小心發生錯誤，未即時校正(Proof-reading)，例如細胞分裂(Cell division)前，在G2 phase偵察到一個A-G配對，此時要用Mismatch repair，將A-G修復成A-T。Mismatch repair同樣是一系列的酶組成，其修補能力也決定年齡增長的突變累積量。Mismatch repair有缺陷的人會在50歲以前罹患大腸癌。
iv)人類23對染色體由32億對A-T/C-G鹼基構成，總長度約兩公尺，當DNA複製及mRNA合成時，雙股DNA要打開，此時DNA會越絞越緊，且染色體之間常會發生糾纏。Topoisomerase(Topo) I/II解決這些問題，如下面的影片：
https://www.youtube.com/watch?v=EYGrElVyHnU
Topo I 會形成一個Single strand break(SSB)，Topo II會形成一個Double strand break(DSB)，正常情況下，SSB與DSB會分別由Topo I與Topo II接起來，如果沒接起來，正在分裂的細胞可經由HR來接合，不分裂的細胞只能經由NHEJ來接合，NHEJ會引發突變。
支氣管上皮細胞30-50天更新一次，肺泡Type I alveolar cell約120天更新一次。大腸上皮細胞5天更新一次。呼吸道的自由基可從痰液排出，大腸的自由基可由糞便排出。細胞更新越快，越容易產生自由基(大腸>>肺)，論致癌物，大腸也遠比肺臟多，為何大腸癌與肺癌的發生率相近？女性肺癌反而多於大腸癌，原因是吸入的氧氣與支氣管/肺泡上皮細胞胞膜上的不飽和脂肪酸直接接觸產生Lipid peroxidation。流經大腸的氧氣則由紅血球攜帶，氧氣不會與胞膜上的不飽和脂肪酸直接接觸。另外，肺泡與支氣管上皮間隙的脂肪越多，越容易發生Lipid peroxidation。
DNA修補包括Base excision repair、Nucleotide excision repair、Mismatch repair、 Homologous recombination、Nonhomologous end joining，各由一系列的酶組成。如果DNA修補有某種程度的缺陷，自認為吃得健康(高級植物油、魚油、生酮飲食等)，胞膜上的多不飽和脂肪酸>80%，可能因Lipid peroxidation反而容易罹患肺癌。如果DNA修補沒有明顯的缺陷，多不飽和脂肪酸(Omega-3脂肪酸如EPA、DHA)稍多一點，可抑制慢性發炎，降低肺癌發生的風險。

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 最近雲林縣某公司製造的辣椒粉被驗出含蘇丹紅3號18 ppb。
https://udn.com/news/story/7266/7763379
ppb換算成濃度：
µg/m³ = (ppb x 12.187 x 分子量)/(273.15 + °C)
蘇丹紅3號的分子量是352.39，1 m³=1000公升(L)。18 ppb約等於0.260 µg/L(=0.00026 µg/ml)。如果炒一盤菜加0.5 ml體積的上述辣椒粉，則有0.00013 µg蘇丹3號被加入菜餚中。1 µg是0.000001克，0.00013 µg是極微的量。
吃下去的致癌物真的會致癌嗎？
關於癌症，請詳讀版上的「腫瘤生物」。
癌細胞是DNA突變造成。DNA突變很常見，>99.99%是細胞自發性的突變，因此只要活得夠久，一個正常細胞有數十個Passenger mutation(無關緊要的突變)很正常，與食物中微量的致癌物幾乎無關。引發癌症的突變是Driver mutation，累積的突變通常會先弱化p53(或直接讓p53突變，使之失去主導DNA修補的功能)，然後一個與細胞分裂有關基因突變成Oncogene(如EGFR、PI-3K、Ras、Raf等)------>癌細胞。如果不先弱化p53的功能，Oncogene先突變成功，p53會因Oncogene活化而穩定(變多)，癌細胞會被p53弄死(走向Apoptosis)。突變-->癌細胞，這一步並不容易。

 
DNA突變的機轉很複雜，以女性的乳癌為例，發生率超高的首因是隨月經週期每月增生的乳腺細胞高達10⁹，每月增生-死亡，死亡的細胞要靠免疫細胞清除，會產生Free radical(自由基)，比吃下去的致癌物高數萬倍。
Free radical可由Glutathione reductase(GR)/peroxidase(Gpx)機制清除。
 
https://academic.oup.com/jrr/article/55/5/831/2751020
乳房是封閉的器官，清不掉的Free radical若無法從泌乳排出，自然就累積在乳房，長期下來就會造成DNA damage，接下來DNA damage-->突變後修復的能力由基因決定，修復力差的女生容易罹患乳癌。預防乳癌的最佳方法就是回歸人類的原始狀態，不斷生小孩，讓Free radical從乳汁排出來。
肺癌發生的主因是肺臟的脂質(Lipid)遇到氧氣自然發性 peroxidation，Lipid含量越高，氧氣造成的Lipid peroxidation越嚴重，產生的Free radical比吃下去的致癌物高數百萬倍，遇上DNA修復能力差的人，就容易罹患肺癌。氧氣進入血液後與紅血球結合，因此氧氣不會在其它器官引發Lipid peroxidation。
   
女性Free radical的產生量，肺臟>>乳房，但女性乳癌>肺癌的原因是肺臟是開放性的器官，產生的Free radical可經由痰液咳出去。預防肺癌的最佳方式是節制飲食，多運動消耗過多的脂肪。
攝護腺是開放性的器官，因此男性攝護腺癌的發生年齡比女性乳癌晚20-30年。
DNA常有自發性的突變，修復能力差的人也容易罹癌。
1. DNA base deamination，Adenine--->Hypoxanthine，Cytosine---->Uracil，G--->Xanthine需要Base excision repair。DNA甲基化只發生在Cytosine(5-methylcytosine)；3-methyladenine與 7-methylguanine 都是錯誤的鹼基，如果發生，也需要Base excision repair。
2. DNA複製時發生鹼基配對錯誤，需要Mismatch repair。
3. DNA Double strand 因複製或基因表現而打開時會發生扭曲，因此需要切斷再接回去。
https://www.youtube.com/watch?v=EYGrElVyHnU
如果沒順利接回去，需要Homologous recombination (HR發生在細胞分裂前)及Non-homologous end joining(NHEJ發生在沒在分裂的細胞)。HR十分精準，不會產生突變；NHEJ常導致Passenger mutation，在某個微小機率下會發生Driver mutation。
以上DNA修補機制若有小缺陷，發生Driver mutation的機率就會高。
關於DNA的修補機制請參考下文：
https://wleemc.pixnet.net/blog/post/117929370

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有人問版主Cancer Biology要讀哪一本書？
Robert Weinberg 的The Biology of Cancer值得讀嗎？
版主認為，花一學期選修Cancer Biology比讀The Biology of Cancer(2013年第二版有點舊)效果好，不懂就直接問老師，原文書(包括Harrison)才能一讀就懂。
Mutant p53 protein monomers are more stable than the normal p53 proteins and can form complexes with the normal wild-type TP53, acting in a dominant-negative manner to inactivate it.
那這時候不是first hit就會使mutant p53去inactivate wild type p53，使p53功能都喪失？為什麼這時還需要second hit才會得到tumor呢？
比如Li-Fraumeni Syndrome為什麼不會出生就因為沒有p53功能，而很快罹患癌症，卻要等到second hit出現呢？
腫瘤生物學在講Tumor suppressor時都會提到Alfred Knudson的Two-hit hypothesis，它完美解釋Retinoblastoma(RB)基因突變引發視網膜腫瘤的機轉，即染色體一股(allele)RB基因先天突變失去功能(First hit)，另一股RB基因仍可正常運作，因而不會出現腫瘤，當有Second hit造成雙股染色體上的RB基因都失去功能時，腫瘤就會發生。
Two-hit hypothesis用在p53有時就行不通了。p53的突變種類繁多，版主暫時將其分為三類：
1.Complete functional loss (突變蛋白是死蛋白)
2.Partial functional loss (突變蛋白仍具p53的部分功能，可視為跛腳蛋白)
3.Dominant negative (突變蛋白強烈抑制wild-type p53的功能)
p53是tetramer，如下圖：
 
四個p53形成tetramer與DNA結合，Tetrameric p53是Transcription factor，經其Transcriptional activation製造出來的蛋白主要攻能是G1 checker、DNA repair及Pro-apoptotic proteins。
如果First hit是p53死蛋白(Complete functional loss)，就會遵守Two-hit hypothesis。
如果First hit的突變p53仍具p53的部分功能，這種跛腳的p53與wild-type(WT) p53結合仍會干擾p53的正常功能，但不致於立刻引發腫瘤，但罹患癌症的機率會大ㄧ些，至於大多少，要看突變的跛腳p53對WT-p53干擾的程度。
如果First hit的突變p53是Dominant negative，它會與WT-p53結合使其完全喪失功能，就是Oncogene。
比方說，約有30-50%胃黏膜層的Intestinal metaplasia可測到p53突變，但通常不會立刻引起胃癌(離癌化還很遠，只是統計上胃癌發生機率變高一點)。然而正常的大腸黏膜p53很少突變，但一有突變可能在短時間內形成大腸癌(The mutant p53 is a dominant negative oncogene)。
問題中的「Li-Fraumeni Syndrome為什麼不會出生就因為沒有p53功能，而很快罹患癌症，卻要等到second hit出現呢？」，其實突變那一個Allele的p53可能是死的p53，Second hit還要看狀況，如果也是死的p53，罹患癌症機會比跛腳的p53大(跛腳仍具部分功能)。First hit也可能造成跛腳p53，病人罹患癌症的機率比正常人會大ㄧ些。如果First hit是Dominant negative p53，病人在嬰幼兒時期就可能罹癌。

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HPV (Human papilloma virus)是子宮頸上皮細胞癌化最重要的因子，昨天有人問版主，HPV E7蛋白可抑制p21^Cip1及p27^Kip1，這兩個蛋白都是CyclinD-cdk4/6的inhibitor，p16^Ink4a也是CyclinD-cdk4/6的inhibitor，為何Robbins教科書會寫「Both Ki-67 and p16 stainings are highly correlated with HPV infection」？ p16難道不會也被E7抑制嗎？

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病理課本Neoplasm章節寫：Of interest, when RAS mutations are present in a tumor, activating mutations in receptor tyrosine kinases are almost always absent, at least within the dominant tumor clone, implying that in such tumors activated RAS can completely substitute for tyrosine kinase activity.
Thus, lung adenocarcinomas fall into mutually exclusive molecular subtypes that are associated with mutations involving RAS or various tyrosine kinase genes, an insight that has important implications for targeted therapies in this type of cancer.
這代表一個腫瘤的subclone不會同時有「同一個pathway的上下游genes」突變嗎？

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68歲女性，家住南部，B型肝炎病毒帶原，肝功能一直正常，追蹤至64歲，HBs消失，且產生Anti-HBs antibody，她以為自己沒有B型肝炎了，最近四年忽略了超音波的追蹤檢查，今年五月健檢發現肝臟Caudate lobe有一個4公分的肝癌，雖然不大，但已造成肝門靜脈栓塞(Portal vein thrombosis)！
 
肝臟左葉Caudate lobe四公分的肝癌

 
肝門靜脈進入肝臟的超音波影像顯示肝門靜脈充滿血栓
 
肝臟外的肝門靜脈也充滿血栓(綠色虛線標示肝門靜脈的直徑)

B型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)帶原者是B肝病毒與肝臟和平共存，ALT與AST正常，但肝癌發生率是正常人的100倍，如果是慢性肝炎(ALT常大於兩倍正常值，即80 U/L以上)，肝癌發生率是正常人的500-1000倍。HBV已在上述病人肝臟存在數十年，突變效應早已發生，HBs消失與Anti-HBs產生，不代表病毒完全消失，抽血測病毒量，她的血中仍有微量病毒(26 IU/ml，小於20 IU/ml 就算測不到)。她的肝癌四公分大，但ALT/AST/GGT都正常，即使肝癌已造成Portal vein thrombosis，抽血Total bilirubin及AFP也正常(Total bilirubin 0.47 mg/dL; AFP 3.70 ng/ml)。
她因為HBs消失，anti-HBs出現，四年忽略超音波檢查，等到發現肝癌時，雖然不大，但已造成門靜脈栓塞。
Hepatitis B virus (HBV)有四個基因--S (Surface)、C(Core)、P(Polymerase)、X(X protein)，製造五種蛋白HBs, HBe, HBc, HBx, Polymerase：
 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168827814003043
Pre-S mutant較容易產生ER stress, 肝癌發生機率是Wild type pre-S的四倍. 

 
Hepatitis B virus 的結構如下圖：
 
HBs(Surface antigen)有三種結構，Large (PreS1-PreS2-S ), Middle (PreS2-S), Small (S)，是HBV envelope proteins：
 
HBV 為何會引起肝癌？ 尤其是Healthy HBV carrier，肝功能始終正常，肝臟沒有慢性發炎為何罹患肝癌機會是正常人的100倍？
HBV envelope proteins (HBs large, middle, small proteins)在Endoplasmic reticulum(ER)大量累積時，會引發ER stress，也稱為Unfolded protein response (UPS)。肝細胞為了要分解Unfolded protein，就會產生過多的ROS (reactive oxygen species)，DNA受ROS攻擊的機會也會增加，例如Guanine變成8-oxoguanine (8-OG)，肝細胞就會產生8-oxoguanine glycosylase 1 (ogg1)來切除(8-OG)，進行Nucleotide excision repair (NER)。
HBx不參與病毒結構形成，但可活化病毒核酸(cccDNA)複製/轉錄、調控肝細胞基因表現(例如Activate oncogenic PI3K/Akt signaling)、並干擾肝細胞DNA修補(bind and inhibit p53; bind and inhibit proteins for nucleotide excision repair )，如下圖：
 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5691655/
1. HBx與p53結合，抑制p53對DNA突變的反應。當CD8⁺ T cell 發現肝細胞MHC-I分子表現HBV peptide而攻擊肝細胞(慢性肝炎的病因)，肝細胞死亡後再生需要p53調控G1 phase，若DNA有突變，p53可引發G1 arrest，先修補DNA再讓Cell cycle通過G1 phase。
2. HBV envelope proteins (Large, Middle, Small HBs) 尤其是PreS2 mutant會誘發ER stress，肝細胞會因ROS累積過多而增加DNA的突變機率。DNA若發生突變，需要Nucleotide excision repair(NER)來修補，HBx與NER的蛋白(XPB, XPD, TFIIH)結合，干擾Transcription-coupled (TC)-NER。
3. ROS若造成DNA double strand break (DSB)，肝細胞會誘導DSB repair (DSBR)，PreS 及其mutant會抑制DSBR 的MRE11–RAD50–NBS1 (MRN) complex 形成。
4. SMC5/6參與多項染色體結構/分離及DNA複製/修補的功能，若與B肝病毒的cccDNA結合，會抑制cccDNA的Transcription。HBx與DDB1-Cul4 complex(E3 ligase)結合，促使SMC5/6進入Ubiquitin-proteasome degradation pathway分解，B肝病毒的cccDNA就可順利進行Transcription。

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五十歲以上的醫師過去三十年若沒在基礎醫學上進步，登上講台教學不敢碰G protein，所以有國醫學生說三總主治知識貧乏，這不難理解，因為1970/1980年代課堂上不教G protein，畢業後即使G protein已寫進教科書，也沒時間把它弄懂。關於G protein，只要你能想到的生理反應，G protein都參與其中。在本篇文章，版主把入伍訓讓人變瘦的G protein 所傳遞的訊息整理一下。
   
傳統道地的入伍訓非常辛苦，一天24小時處在濕熱的環境中。人體對於溫度感覺的神經原(neuron)存在於背根神經結(Dorsal root ganglion, DRG)與三叉神經結(Trigeminal ganglion, TG)，接收來自各個器官的Thermosensor—ThermoTRP (transient receptor potential) ion channel，每一種Thermosensor感應不同的溫度：
 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4594430/
G protein 參與冷熱的調控，可能的機轉如下：
 
Bradykinin (BK)是一種人體內在的發炎胜肽，作用於GPCR (G protein coupled receptor)可模擬攝氏42度的環境，G protein活化後，Gq(a)-GTP活化PLC-b。PLC-b將PIP2水解成IP3與DAG。DAG活化PKC (Protein kinase C)，PKCe將TRPV1磷酸化(Ser508/Ser801)。如果是Prostaglandin E2與GPCR結合，G protein 活化後，Gs(a)-GTP就會活化Adenylate cyclase導致cAMP增加，cAMP再活化Protein kinase A(PKA)，PKA再將TRPV1磷酸化(Ser166)。離子在磷酸化的TRPV1 channel流動來傳遞「熱」的訊息。
皮膚細胞感應到環境的溫度後，訊息傳遞   GPCR-G protein-TRPV1-phosphorylation，TRPV1(或其它TRP ion channel)因磷酸化而活化，將「熱」的訊息傳到DRG/TG，再往上傳至brainstem、limbic system/prefrontal cortex、及其它Cerebral cortex：
DRG (Dorsal root ganglion)--Spinothalamic tract--Brainstem reticular formation 
TG (Trigeminal ganglion)--Brainstem reticular formation 
上面的神經傳遞，每個神經細胞之間要靠Neurotransmitter傳遞訊息，舉例而言Spinothalamic tract的Excitatory neurotransmitter主要是Glutamate，Glutamate receptors有數十種，分為兩大類：
Ionotropic：Glutamate與Receptor結合後直接影響離子(Ion)在胞膜Ion channel的流動。
Metabotropic：Glutamate與Receptor結合後活化G protein造成Ion在胞膜上的流動。
熱的訊息傳遞到Brainstem會使交感神經興奮，傳到Limbic system-Prefrontal cortex會有情緒的反應與記憶，人體對熱的感覺則在大腦皮質(Cerebral cortex)。神經細胞與神經細胞間的訊息傳遞如同Glutamate-Receptor，離不開G protein。入伍生活最大的特點是長期處於一般人不喜歡的高熱環境(攝氏28-32度)，交感神經長期處於興奮狀態，體內Norepinephrine(NE)高於常態，這有三個主要的效應：
1. NE-b2 receptor，作用在肝臟，G protein 活化，Gs(a)-GTP活化Adenylate cyclase導致cAMP增加，cAMP再活化Protein kinase A(PKA)，PKA將Glycogen phosphorylase 磷酸化，肝醣水解，葡萄糖從肝臟釋出供給各器官所需(入伍訓很耗體能)。
2. NE-b3 receptor，作用在脂肪細胞，G protein 活化，Gs(a)-GTP活化Adenylate cyclase導致cAMP增加，cAMP再活化Protein kinase A(PKA)，PKA將perilipin 磷酸化，促使脂肪酸從Lipid droplet水解釋出供給各器官所需。
3. 交感神經興奮，作用於汗腺(Acetylcholine-Muscarinic receptor)，可經由Gs(a)及Gq(a)兩個路徑促使Cl^-自汗腺細胞排出，Na⁺與水跟著Cl^-排出(Na⁺ 經由Sodium channel，H2O經由Aquaporin)，如下圖所示：
 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143416016302147

汗腺Cl^- 排出經由兩個途徑(如上圖B，Cl^-從圖A的Acinar cells排至Lumen)：

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入伍生已抵達陸官，我們來回顧某位國醫學生在版上提到的G protein coupled receptor (GPCR)。G protein與入伍訓有何關係？如果你讀懂G protein，你會發現G protein不僅是醫學的東西，它還參與人類處於非常狀態下的應變力，入伍訓可以說是十八九歲的人所經歷過最特殊的非常狀態。版主先解答某位M117學弟的生化問題：
 
Q: Ca²⁺-gated chloride channels open會造成 Cl^- 流出造成去極化。但是一般而言， Cl^- 濃度應是胞外大於胞內，為何開此通道可以造成Cl^-向外流？這個通道是active transport嗎？
A: 這是Lehninger 第12章關於嗅覺的訊息傳遞。人類嗅覺受體(Olfactory receptor)超過800種，下游的Ga(G_olf)也隨受體的不同而不同。Trimeric G protein 包括 Ga/Gb/Gg，其中Ga是鑑別訊息的關鍵。嗅覺是經由神經傳導來讓人感覺味道，所以嗅覺細胞是Excitable cell，嗅覺受體接收空氣中的分子而讓嗅覺細胞去極化(Depolarization)。Excitable cell的極化(Polarization)不是看單一的離子(如 Cl^-)，而是靠ATPase(Pump)調整細胞內各種正/負離子，使得胞膜外呈++++，胞膜內呈-----，這叫Polarized(極化)。如果負電荷的Cl^- 大量離開細胞，胞膜內負電荷(------)少了，就會depolarized(去極化)。圖中Cl^-的通道是Ca²⁺-gated channel，只要Ca2+濃度高到一定程度就會打開讓Cl^- 流出去，不需Active transport，能量的來源是Trimer G protein (G_olf-Gb-Gg)活化後水解GTP而來。
不僅嗅覺如此，聽覺、視覺也類似。事實上，G protein無所不在，當你站在太陽底下兩小時，全身細胞的G protein支撐著你，葡萄糖從肝臟運出來提供能量，如果還不夠，脂肪酸從全身 "油脂" 水解出來，全都是G protein努力在運作，可以想像入伍訓兩個月你會變成怎樣。你絕對不會忘記在陸官的第一天，版主當年的第一天十分經典，早上9:00~11:00，三千名入伍生站在操場上編連，班長神出鬼沒，不小心可能站在你耳邊說一聲：「手不會貼是不是」，兩小時站下來是很難過的。編完連，我被編在入十二連，這是命運的安排，被帶到入十二連，第一件事是跟班長見面，在連集合場十二個班帶開，班長吼叫聲此起彼落，如果你現在還記得，從過去到現在都是G protein的訊息傳導作用。11:30進餐廳，我依然記得我們入伍生在餐廳外等進場時那套神聖的儀式，一二一二、答數、長答數  ~~~~~精神答數~~~~~~，入伍生的答數聲已經夠響亮了，可餐廳裡面班長的重砲聲仍一陣一陣清晰地傳出來，威力之強真把外面等待進餐廳的入伍生給震懾住了。經歷過的人應該都記得，還沒進餐廳，光聽到裡面班長的叫囂，全身就已發麻發涼，當時真的不想進去(但可以不進去嗎？)，又不得不硬著頭皮像上戰場般闖進去，那種感覺一輩子都不會忘記，我想，這種經歷已成絕響了吧！有趣的是，所有當年恐懼的、緊張的，流過的汗，聽到的，看到的，聞到的，想逃離的，~~從撐過去就是你的(一種詭異的想法)，到撐完最後一天感覺恍如昨日，以及保留到現在的記憶都歸因於G protein傳遞一系列你當時想像不到的訊息告訴你要撐完到結訓。如果有人想退訓，也是G protein讓他感覺必須離開才能解脫。
1980s初期版主只是個懵懵懂懂的醫學生，G protein coupled receptor (GPCR)尚未寫進教科書，但GPCR從此時開始一步一步登上醫學的主要舞台，下圖是GPCR的總結，任何你能想到作用於細胞的刺激，以及對刺激的記憶，都會啟動G protein向下傳遞各種不同的訊息：

 
https://www.nature.com/articles/emm2015105/figures/1
Gas：增加cAMP，如Epinephrine作用於心臟的b1 receptor讓心跳加快。
Gai：降低cAMP，如Acetylcholine作用於心臟的M2 receptor讓心跳減慢。
Gq：促使PIP2經由Phospholipase C 轉變成IP3 與DAG。IP3促使Ca²⁺從ER釋放出來，Ca²⁺-Calmodulin再活化其它蛋白。DAG活化Protein kinase C。
G12/13：活化RhoGTPase，參與細胞移動，也與癌症轉移有關。
不只如此，從精子與卵的遇合，G protein就啟動你的生命並決定你的命運：

 
當你讀完GPCR，你有甚麼感覺？有沒有用？如果沒用，讀它幹嘛？真的沒用嗎？
今年六月28日美國FDA核准第一個Anti-GPCR antibody(Erenumab, AMG-334)上市用來治療偏頭痛(Migraine)。
https://www.nature.com/articles/nrd.2018.103?WT.mc_id=FBK_NatureReviews

其它有關於Anti-GPCR therapy正在臨床試驗中：
 
https://www.nature.com/articles/emm2015105#f1

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昨天有訪客要版主評論「23魔方」基因檢測：
https://www.23mofang.com/
上面網站檢測的基因仍太少，二十年內，「Whole genome sequencing」將人類23對染色體上的DNA全部定序，會像手機一樣普及化，大部分的人都有能力購買自己的「Whole genome sequencing」及附加機器人軟體，你想要知道甚麼疾病與你的基因序列相關，機器人都會告訴你，因此醫師未來要面對的不只是病人，更難纏的是病人手上的機器人。版主用下面一個病例來說明生化、分生、免疫、胚胎學及細胞生物在診斷疾病的重要性，你如何用醫學知識來說服知識水平特高的病人。
41歲男性，因在頸部甲狀腺所在的部位摸到一個腫塊，他先去長庚醫院做切片，接著又去台大醫院做了一次切片，切片中都出現Squamous cell (鱗狀細胞)，因為病人在長庚與台大兩家醫院都問不出個所以然來，於是到北榮又做了一次切片。沒錯，甲狀腺不應該出現Squamous cell，這種上皮細胞應出現在食道與氣管，於是新陳代謝科醫師把病人轉給我，我摸了一下病人頸部的腫塊，軟軟的約2-3公分，一看到病理報告上寫著(Presence of squamous cell)，我大概就知道是怎回事了，於是立刻排了電腦斷層，結果與我事先的猜測相同。
 
上圖紅箭頭是氣管，綠箭頭是病人頸部摸到的腫塊，約兩公分，裡面有Squamous cell，因此應該是一個類似突出於食道或氣管的憩室(Diverticulum)。這個憩室是如何形成的？為何病人到四十歲才發現？這是個胚胎學的問題：
 
胚胎發育中，食道與氣管來自Foregut，約在發育的一個月左右，Foregut會突出一個Lung bud長成氣管，於是氣管便與食道平行發育成兩個管腔。來自外胚層能分化為Squamous cell的Stem cell會往食道及氣管移動，在移動的過程中有幾個Stem cell跑錯地方，到了中胚層肌肉的位置。Stem cell在肌肉層類似食道或氣管仍會受到各種Growth factor的影響分化為Squamous cell，有趣的是，為何病人到四十歲才長兩公分？因為這種Squamous cell的壽命長達半年，儘管Stem cell會分裂分化為Squamous cell，但可能半年才死亡更新一次，死亡的細胞由免疫細胞吞食在頸部產生無感的發炎反應，緩慢且週期性的細胞更新死亡在封閉的系統中進行，於是在系統中堆積發炎組織與液體而漸漸擴大，花了四十年形成一個兩公分的憩室。電腦斷層影像中，氣管與憩室的距離已不到0.5公分，如果不早點做外科處理，憩室可能擴大穿破氣管。

從Stem cell分化成Squamous cell需要多種Growth factor的Signaling transduction來調控，包括：EGF receptor、FGF receptor、Wnt、TGF-b receptor、Hedgehog/Gli、Notch 等Signaling，這些是生化/分生及腫瘤生物的範圍。我把這些資訊告訴病人，他終於放下心中的一塊大石~他沒罹患Squamous cell carcinoma(鱗狀細胞癌)。有趣吧！這病例的重點在長庚與台大的醫師都只要他繼續追蹤，但從胚胎、生化、分生、免疫及腫瘤生物的觀點，該憩室必須外科治療，否則可能穿破氣管，另外密閉系統中的發炎反應也易引發癌變，不可不慎。

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