人生沒有用不到的經歷

關於新冠病毒的篩檢，RT-PCR有一個數值叫「Ct (Threshold cycle) value」，衛福部防疫指揮中心的陽性是Ct < 35，比利時工程師的檢體，做三段PCR，其中一段Ct=33.~，另外兩段Ct >35。
https://www.chinatimes.com/newspapers/20200804000512-260114?chdtv

為何以Ct <35做為陽性的判定標準？這與可偵測到 “高於底線(Threshold)” 的螢光(Fluorescence)值有關。

新冠病毒是RNA病毒，實驗第一步是用Reverse transcriptase將RNA轉換成cDNA。

每一段PCR產物是以cDNA當Template，由Forward + Reverse primers來完成。為了偵測每一個Cycle dsDNA的合成，Real time PCR會加入螢光Probe，如下圖所示：

 
圖一：Reporter是發螢光的有機化物如FITC、FAM等，Quencher是遮蔽螢光的有機化物如BHQ1、3IABkF等。Reporter與Quencher之間由一段能與新冠病毒cDNA配對的Oligonucleotide連接。當Reporter與Quencher距離夠近，Reporter的螢光就會被Quencher遮住。當Probe的Oligonucleotide被Taq DNA polymerase 切除後，Reporter與Quencher便會分開，Reporter就會發出螢光。

Real time PCR反應時，Taq DNA polymerase不但有DNA polymerase活性，遇到擋在前面的螢光Probe，會用 5´–3´ exonuclease活性將螢光Probe的Oligonucleotide切掉，於是Reporter與Quencher就會分開，
 
圖二：Taq DNA polymerase有5´–3´exonuclease活性，可將螢光Probe切掉，使Reporter (R)與Quencher (Q)分開。Reporter的螢光脫離Quencher就會發出來被偵測到。

PCR剛開始做時，測到的螢光是雜訊，如下面Youtube影片，從2:50開始看，IAC(Internal amplification control)可以用某個 "極低" Copy number (or picogram)新冠病毒的ds cDNA來設定，當IAC PCR做到第35個Cycle時，螢光開始往上走，達到某個 "高於雜訊、可偵測到" 的Fluorescence threshold，代表只要在與IAC同樣的反應情況下(極低的起始 ds cDNA)，Target (如新冠病毒cDNA的量)若能顯出往上走的螢光，就是陽性。


 
https://www.youtube.com/watch?v=C6pHZXFXq1c
圖三：Youtube影片3:30的截圖。IAC大約做到第35個Cycle，螢光開始往上走。Target大約做到第17個Cycle，螢光就往上移了，代表Target是強陽性，Ct = 17.~。

為了精算IAC的Cco (Control of Threshold cycle)及Target sample的Ct，可將曲線中每個Cycle校正過的螢光值(RN, Normalized fluorescence value of reporter)減掉雜訊(Baseline)的RN，然後以△RN為縱座標，Amplification cycle為橫坐標，得到下面的曲線圖：

 
圖四：如圖三，當IAC PCR做到第35個Cycle時，螢光開始往上移，當上移的RN減Baseline雜訊的RN有「顯著」差別時(△RNco)，這一點介於第35與第36 cycle之間。第35 cycle起始的RN減Baseline雜訊的RN為△RN35，第36 cycle起始的RN減Baseline雜訊的RN為△RN36。以比例來計算△RNco/(△RN36-△RN35)=0.X，如果算出X=0.19，陽性的Cut-off即Cco=35.19。綠色橫線(Threshold)在Y軸的螢光值是△RNco。藍色曲線與Threshold交會點的Ct約10~是Strong positive；黃色曲線與Threshold交會點的Ct > 35.19 是Negative，但離Ct=40還遠，也可能是False Negative；紫色曲線與Threshold交會點的Ct > 40 是明顯的Negative。