人生沒有用不到的經歷

腫瘤生物寫到第14, 15回時，出現兩個時髦的名詞：
Homologous recombination (HR) 或Homology-directed repair(HDR)
Non-homologous end joining(NHEJ)
這兩個名詞於2012年因CRISPR-Cas9紅了起來。2012年以前，醫學生可以不知道HDR/NHEJ，但2012年以後，如果你不想知道HDR/NHEJ，建議你不要來學醫。
CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeats
Cas: CRISPR-associated proteins

CRISPR-Cas9源自細菌對噬菌體(Bacteriophage)的免疫觀念。台灣現在很少人在養噬菌體，我們把時間推到1990年代，當時l phage genome是實驗室中常用的cDNA或Genomic DNA的Cloning vector。養l phage需要一點技巧，因為常會出現E. coli的免疫現象，就是當你把l phage與E. coli混和在一塊兒養了半天，結果發現l phage產量少得可憐。誰會想去研究E. coli的Adaptive immunity？如果1990年代你一頭栽進E. coli的Adaptive immunity，會找到CRISPR-Cas系統嗎？答案是否定的，E. coli沒有CRISPR-Cas，因為E. coli的H-NS regulator會抑制CRISPR-Cas系統的形成。CRISPR-Cas系統可算是某些細菌的Adaptive immunity，但不要忘了Autoimmunity(自體免疫)的風險，Cas endonuclease也可能切斷細菌的DNA。E. coli顯然比較聰明，它有更好的方式來產生Immunity against phage，因此拒絕了CRISPR-Cas進入它自己的Genome。
https://www.nature.com/articles/nrmicro2315
Bacteriophage resistance mechanisms
這篇文章寫細菌如何對抗 phage，值得一讀，如果你無法Download，版主可以寄給你。

CRISPR-Cas已不算新知識，但Lehninger第七版才有，如果你想了解這系統的梗概，今年一月的Scientific American有一篇文章也值得一讀：
https://www.scientificamerican.com/article/5-big-mysteries-about-crisprs-origins/

    
如上圖所示，Phage(Virus)入侵細菌後，細菌可能會盜取一段Phage的DNA，把它插進細菌自己的Genome。你看上圖有一個CRISPR array，裡面有各種Phage的DNA片段(Spacers)，當之前入侵的Phage再度入侵時，細菌會用那段盜來DNA為模板，合成RNA與Phage的DNA配對。每種細菌有它自己的Cas endonuclease，在DNA-RNA配對的特殊序列上切斷Phage DNA，這樣Phage就死了。但CRISPR-Cas有風險，那段RNA既然能與Phage DNA配對，當然也會回過頭來跟細菌自己CRISPR array上的DNA進行配對，因此Cas endonuclease也可能切斷細菌的Genome，引發Autoimmunity造成自我毀滅。所以，E. coli 就比較厲害，反而會用H-NS regulator剔除CRISPR array，因為E. coli有更好的免疫機制來對抗Phage入侵。

CRISPR-Cas9來自Streptococcus pyogenes，它的作用機制很特別：
 
如上圖，Tracr RNA與Cas9都是細菌的東西，你只要在Tracr RNA後面接上人類Genomic DNA相對的RNA序列(Guide RNA)，請注意，DNA-RNA配對序列之前在Genomic DNA必須有PAM sequence(NGG)，這樣Cas9就會在特定部位造成Double strand break。
PAM: Protospacer adjacent motif
 
上圖是你想在細胞Genomic DNA上編輯的Target DNA sequence，紅色三角形是Cas9切割的部位(從NGG往前數三個鹼基)。把Target DNA sequence接進廠商設計好的Plasmid就可以操作Gene editing：

 
如上圖，Plasmid上有Cas9基因，你只要設計Target DNA sequence，接進如上的Plasmid，再將Plasmid送入細胞，細胞就會表現Cas9及Guide RNA：

 
如上圖，細胞接收Plasmid後表現Cas9及Guide RNA，Genomic DNA與Guide RNA配對後，Genomic DNA被Cas9切斷，一個Double strand break會形成。細胞有兩種方式修復Double strand break：
1. HDR(Homology-directed recombination)：你只要給細胞一段Donor DNA(可在某個Plasmid上)，上面有你想改變的DNA序列，只要那段序列前後的DNA與斷裂點的Genomic DNA相同(Homology)，細胞走到G2 phase時，經過HDR就能把你想改變的DNA序列插進Strand break。HDR是隨機發生的，斷裂的Genomic DNA也可能與另一股染色體進行HDR，進行正常的修復。
2. NHEJ：這種修復不精確，常會插入(Insertion)或刪除(Deletion)幾個鹼基(Indel)而造成mRNA的Frameshift，基因就被Knockout(打死)。

下一步是進行篩選，方法很簡單，可將細胞養成一個一個的clone，如下圖每個clone從一個細胞養成數千個細胞，然後把細胞挑起來用PCR及DNA sequencing篩選出Gene editing成功的clone。用CRISPR-Cas9來做Gene editing非常方便，你只要買一個CRISPR-Cas9 plasmid就能輕易將基因做出你想要的改變(Knockout, mutation, insertion, deletion, etc)。
 
上圖顯示細胞的Clones，每個Clone都可挑出來養多，然後抽取DNA，做PCR，DNA定序，這樣就能找到你要的Target DNA sequence在Genomic DNA上所做的改變。

CRISPR array有點像人類抗體基因的V_n-D_n-J_n，乍看之下是細菌盜取了Phage的DNA片段，猶如細菌與病毒的抗原訊息藏在V_n-D_n-J_n之中，歸根究底，這是造物者的傑作，DNA是由簡單的A T C G鹼基組成，物種在大渾沌中形成，各種生命的DNA本來就互相投影，你沒去過非洲蠻荒之地，但去了之後免疫基因自然會表現出來對抗你身旁從未接觸過的細菌，重點是，你在非洲很健康可能從未生病，換句話說，你從未接觸那些細菌，但你對那些細菌先天有免疫力，藏在T cell  receptor及V_n-D_n-J_n之中。