人生沒有用不到的經歷

學弟們好像有被安排進老師的實驗室，有一位學弟提到Genomic DNA 之純化，很多人不曉得其中的 tricks，實驗常失敗，下面是我的經驗：

如果你用 Commercial kit 去純化，要注意細胞 (白血球) 數目不宜過多。

純化的原理是用1% SDS (in TE buffer) 將細胞溶解，然後加 Proteinase K分解 DNA-binding proteins。Proteinase K 要作用overnight。另外要加 RNase A 分解 RNA。

此時你要注意，Proteinase K 常常無法 將 DNA-binding proteins完全分解，但你很難確知 DNA-binding proteins是否真的完全分解！

下一步是 Phenol/chloroform 萃取，注意把 Sample 分成兩管，一管 1/3 另一管 2/3，只萃取 1/3 那一管 (萃取是除去蛋白質碎片)。

離心之後，只吸取上清液 “上面3/4”，下面 1/4 沒把握就不要吸，Interface 很髒勿碰。當你吸取上清液時，如果有東西自 Interface 被 Tip 拉上來，那就是DNA 與 DNA-binding proteins ，這很麻煩，代表 DNA-binding proteins 沒被完全分解。你必須再去離心一次，然後只吸取上面 1/2，其他忍痛丟掉。

萃取兩次之後，加 0.1 volume 3M NaOAc pH5.2 與 1 volume Isopropanol 充分混合後離心將 DNA 沉澱下來。

如果你的下一步實驗 (例如 PCR) 做不出來，很可能是DNA的品質有問題，多半是上述 “Proteinase K 沒將 DNA-binding proteins 完全分解”。 DNA 的品質不好無法挽回，因為 DNA 與 proteins 一起沉澱後就分不開。此時別緊張，你還有 2/3 的 Sample，再加一點 Proteinase K，設法讓 DNA-binding proteins 完全分解。接下來拿一半Sample 去做 Phenol/chloroform 萃取，重覆上面的離心與沉澱。