人生沒有用不到的經歷

DNA定序在生物化學教科書是醫學生修生化時從未理解的片段，即使許多生物醫學領域的博士畢業生也未必能讀懂。

DNA合成的反應如下圖：
   
上圖Primer在細胞中是一段10-12個鹼基的RNA，但DNA定序所使用的Primer是一段長約20個鹼基的DNA，依照上圖DNA Template 3’-end的DNA序列來設計DNA合成所需的5'-pirmer。因此，欲定序的一段DNA，其中一股3’-end的序列必須是已知的，否則就要用人為的方式在一端加上一段已知的DNA序列。

DNA與RNA的差別在Nucleotide上的核糖，如下圖：
 
上圖左側核醣(Ribose)-OH經由Ribonucleotide reductase(RNR)轉變成-H，即去氧核醣(Deoxyribose)。NTP用來合成RNA，dNTP用來合成DNA。

DNA的合成反應如下圖：
 
只要把上圖中藍色的dNTP變成ddNTP(如下圖)，即去氧核糖再缺少一個「-OH」。ddNTP崁入後，DNA的合成就會中止。如果是ddATP，中止的地方便是「A」，如果是ddCTP，中止的地方便是「C」。
 
DNA定序原理很簡單，只要在DNA合成反應中加入少量的ddNTP(dNTP的十分之一或更少)，DNA合成過程中便會隨機被少量的ddNTP中止，崁進ddATP就在Template DNA的A中止，崁進ddTTP就在T中止，崁進ddCTP就在C中止，崁進ddGTP就在G中止。
 
傳統(約1995年以前)用具有放射性的³⁵S-dCTP參與DNA定序反應來標示DNA合成，分為G、T、A、C四個反應試管，每個試管中的Reaction mixture含有
1. DNA template (約2 ug先在95℃把雙股DNA開，然後放在冰上)
2. Primer (0.5-1 uM)
3. dNTP (即dATP + dTTP + dCTP + dGTP，各0.2 mM)
4. ³⁵S-dCTP (每管加0.5 uL)
5. DNA polymerase (每管加0.5 uL)
6. 10x Buffer (1 ul)
以上設計成9 ul

試管 G：9 ul Reaction mixture + 1 ul ddGTP (final 20 uM)
試管 T：9 ul Reaction mixture + 1 ul ddTTP (final 20 uM)
試管 A：9 ul Reaction mixture + 1 ul ddATP (final 20 uM)
試管 C：9 ul Reaction mixture + 1 ul ddCTP (final 20 uM)

Sequencing reaction在37℃，5分鐘即完成，然後加入Loading dye(裡面含有EDTA及Formamide，EDTA可與Mg⁺結合，中止反應；Formamide可防止已合成的³⁵S-DNA加熱至65℃後再與Template形成雙股)，合成的單股³⁵S-labeled DNA跑8-10% Polyacrylamid gel即可得到下面的結果：
 

1990年以後，綠、紅、黃、藍的螢光化物被應用在DNA sequencing，即把ddNTP用綠(ddATP)、紅(ddTTP)、黃(ddGTP)、藍(ddCTP)四種螢光化物標示，Sequencing reaction只需做一管，裡面含有：
1. DNA template (約2 ug先在95℃把雙股DNA開，然後放在冰上)
2. Primer (0.5-1 uM)
3. dNTP (即dATP + dTTP + dCTP + dGTP，各0.2 mM)
4. 20 uM 綠-ddATP、紅-ddTTP、黃-ddGTP、藍-ddCTP
5. DNA polymerase (0.5 uL)
6. 10x Buffer (1 ul)

Total 10 ul，反應5分鐘後即可加入Loading dye跑Polyacrylamide gel，結果如下圖：
 
現在實驗室做生醫研究的DNA sequencing都是送給廠商做，拿到的結果如下圖3：
 
https://www.sigmaaldrich.com/TW/en/technical-documents/protocol/genomics/sequencing/sanger-sequencing