人生沒有用不到的經歷

有訪客讀了下文，引出一些新問題。
https://wwwnc.cdc.gov/eid/article/26/6/20-0516_article
文中作者用SARS-CoV-2感染A549 cell (人類肺腺癌細胞株)、HUH7.0 cell(人類肝癌細胞株)、HEK-293T cell(表現Simian vacuolating virus-40 Large T antigen的人類胚胎腎細胞株)、EFK-3B cell (黃蝙蝠腎細胞株)、Vero E6 cell/Vero CCL81 cell(綠猴腎細胞株)，只有Vero E6 cell與Vero CCL81 cell能培養出大量的病毒，並使細胞產生CPE (Cytopathic effect)。

 
圖一：SARS-CoV-2感染Vero E6 cell與Vero CCL81 cell的比較
A:Vero E6產生的病毒量是Vero CCL81的10倍
B:肉眼可見病毒的CPE將長滿培養皿的細胞溶解成一個一個空洞。
C:顯微鏡下的CPE(Dilution 10²)

 
圖二:顯示HUH7.0及HEK-293T能製造Nucleocapsid(N)(B)，但無法製造Spike protein(S)(C)，而且除了Vero E6與Vero CCL81之外，其它細胞株都無法產生Spike protein(C)，由此可知，病毒可進入A549、HUH7.0、HEK-293T、EFK-3B cell複製RNA(A--HUH7.0> HEK-293T > A549 > EFK3B，都比Vero cell少，可能原因很多，宿主缺少幫助病毒RNA複製的蛋白X或microRNA，或者宿主有蛋白Y或microRNA干擾病毒RNA複製)，但無法組裝成完整的病毒顆粒。若缺Spike，則組裝出來的病毒不具感染性(HUH7.0、HEK-293T)。若缺Nucleocapsid則完全無法組裝病毒(A549、EFK-3B)。

 
圖三：顯示HUH7.0在感染72小時之後，細胞萃取液(Cell)及培養基上清液(Supernatant)都不具感染性。何以如此？因為Vero E6與Vero CCL81無法產生IFN-a and IFN-b，但HUH7.0被病毒感染後會產生IFN-a and IFN-b。從病毒進入細胞開始，細胞就會產生Pro-inflammatory cytokines (IL-1b、IL-6、IL-8等)及Anti-viral cytokines (IFN-a and IFN-b)。細胞培養沒有免疫細胞參與，因此Pro-inflammatory cytokines用處不大。IFN-a and IFN-b作用回HUH7.0細胞後，可使細胞產生Anti-viral proteins與microRNA。你可以觀察，只有Vero E6與Vero CCL81能製造出Spike protein，代表其它細胞株可能經由RNA editing(Induced anti-viral proteins, such as APOBECs and ADARs)誘導Spike protein產生致命的突變，可能製造出一個C-to-U mutant，恰巧遇上Stop codon (UAA、UAG、UGA)，Spike protein製造中途就停止；也可能產生一個突變，造成不穩定的Misfolded spike，直接進入Proteasome degradation。HUH7.0剛被病毒感染時，RNA editing活性較低，Spike protein仍可完整製造出來，但72小時之後，RNA editing活性達到最高，因而不再有完整的Spike protein被製造出來，組裝出來的病毒不再具有感染性。也許有些人的呼吸道上皮細胞被新冠病毒感染後，天生就具有RNA editing活性能將Spike protein突變成Inactive mutant。兩年下來，南韓、日本、越南、新加坡感染新冠病毒死亡人數佔總人口不到0.05%。

 
https://www.invivogen.com/review-type1-ifn-production
圖四：病毒一進入細胞，細胞就會產生Pro-inflammatory cytokines (NF-kB targeted genes---IL-1b、IL-6、IL-8等)及Anti-viral cytokines (IFN-a and IFN-b)。病毒的核酸(DNA/RNA)會活化上皮細胞的TLR-3, -7/8, -9，下游有共同的IRF7磷酸化(IRF7-P)，傳遞訊息至細胞核，促使IFN-alpha及IFN-beta基因轉錄--->RNA--->IFN-alpha蛋白及IFN-beta蛋白。IFN-a及IFN-b再作用回上皮細胞，圖的右側，IFNa/b--IFNAR1/IFNAR2--->Tyk2-Jak1----->IFN-stimulated genes---即Anti-viral effectors，包括PKR, RNase L, Matrix protein, anti-sense RNA, RNA editing, etc.因此，將IRF7 gene knockout就可block anti-viral gene expression，建立能養出病毒的細胞株。這些Signal transductions可單獨發生在上皮細胞感染初期，不需要其它免疫細胞參與，是無症狀感染的原因之一，也可能發生在急性感染T cell immunity將病毒局部化，由免疫細胞 "直接" 分泌大量IFN-alpha/beta作用在被病毒感染的上皮細胞。如果要製造出一個方便培養病毒的細胞株，可以把IRF7基因剔除(Knock out)。

這篇很難懂，若有問題可留言，版主再補充。