關於新冠病毒的篩檢,RT-PCR有一個數值叫「Ct (Threshold cycle) value」,衛福部防疫指揮中心的陽性是Ct < 35,比利時工程師的檢體,做三段PCR,其中一段Ct=33.~,另外兩段Ct >35。
https://www.chinatimes.com/newspapers/20200804000512-260114?chdtv
為何以Ct <35做為陽性的判定標準?這與可偵測到 “高於底線(Threshold)” 的螢光(Fluorescence)值有關。
新冠病毒是RNA病毒,實驗第一步是用Reverse transcriptase將RNA轉換成cDNA。
每一段PCR產物是以cDNA當Template,由Forward + Reverse primers來完成。為了偵測每一個Cycle dsDNA的合成,Real time PCR會加入螢光Probe,如下圖所示:
圖一:Reporter是發螢光的有機化物如FITC、FAM等,Quencher是遮蔽螢光的有機化物如BHQ1、3IABkF等。Reporter與Quencher之間由一段能與新冠病毒cDNA配對的Oligonucleotide連接。當Reporter與Quencher距離夠近,Reporter的螢光就會被Quencher遮住。當Probe的Oligonucleotide被Taq DNA polymerase 切除後,Reporter與Quencher便會分開,Reporter就會發出螢光。
Real time PCR反應時,Taq DNA polymerase不但有DNA polymerase活性,遇到擋在前面的螢光Probe,會用 5´–3´ exonuclease活性將螢光Probe的Oligonucleotide切掉,於是Reporter與Quencher就會分開,
圖二:Taq DNA polymerase有5´–3´exonuclease活性,可將螢光Probe切掉,使Reporter (R)與Quencher (Q)分開。Reporter的螢光脫離Quencher就會發出來被偵測到。
PCR剛開始做時,測到的螢光是雜訊,如下面Youtube影片,從2:50開始看,IAC(Internal amplification control)可以用某個 "極低" Copy number (or picogram)新冠病毒的ds cDNA來設定,當IAC PCR做到第35個Cycle時,螢光開始往上走,達到某個 "高於雜訊、可偵測到" 的Fluorescence threshold,代表只要在與IAC同樣的反應情況下(極低的起始 ds cDNA),Target (如新冠病毒cDNA的量)若能顯出往上走的螢光,就是陽性。
https://www.youtube.com/watch?v=C6pHZXFXq1c
圖三:Youtube影片3:30的截圖。IAC大約做到第35個Cycle,螢光開始往上走。Target大約做到第17個Cycle,螢光就往上移了,代表Target是強陽性,Ct = 17.~。
為了精算IAC的Cco (Control of Threshold cycle)及Target sample的Ct,可將曲線中每個Cycle校正過的螢光值(RN, Normalized fluorescence value of reporter)減掉雜訊(Baseline)的RN,然後以△RN為縱座標,Amplification cycle為橫坐標,得到下面的曲線圖:
圖四:如圖三,當IAC PCR做到第35個Cycle時,螢光開始往上移,當上移的RN減Baseline雜訊的RN有「顯著」差別時(△RNco),這一點介於第35與第36 cycle之間。第35 cycle起始的RN減Baseline雜訊的RN為△RN35,第36 cycle起始的RN減Baseline雜訊的RN為△RN36。以比例來計算△RNco/(△RN36-△RN35)=0.X,如果算出X=0.19,陽性的Cut-off即Cco=35.19。綠色橫線(Threshold)在Y軸的螢光值是△RNco。藍色曲線與Threshold交會點的Ct約10~是Strong positive;黃色曲線與Threshold交會點的Ct > 35.19 是Negative,但離Ct=40還遠,也可能是False Negative;紫色曲線與Threshold交會點的Ct > 40 是明顯的Negative。
- Aug 05 Wed 2020 13:06
漫談免疫學-62(RT-PCR的Ct值)
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