現在臨床上使用的治療性抗(Therapeutic antibody)HumanHumanized antibody為主,Mouse Chimeric antibody仍有但會被漸漸淘汰1986年上市的anti-CD3 antibody (Muromonab-CD3),用於對抗器官移植的排斥作用Mouse monoclonal antibody1997年上市的anti-CD20 antibody (Rituximab),用於治療 Non-Hodgkin's lymphomaChimeric mouse-human antibody1998年以後,美國FDA核准上市的Therapeutic antibody以Humanized antibody為主,現在的趨勢則是以Phage antibody library篩選Purely human antibody

有醫學生問到「Humanized antibody」,到底Humanized antibody Human antibody是怎樣造成的差異?
關於Chimeric antibody, humanized antibody, human antibody 如果沒有好的生化基礎及分子生物的實戰經驗,絕對看不懂Textbook及Review article在寫些甚麼,卷哥卷姊恐怕也是讀天書,霧煞煞


下圖顯示Therapeutic antibody的演變
chimeric and humanized antibody  
圖一治療性抗體之演變,土黃色區域來自Mouse monoclonal antibody,藍色區域是Human antibody 的成份

Mouse antibody
Monoclonal antibody是小鼠經抗原(antigen)刺激後取出脾臟的淋巴細胞與骨髓瘤細胞(Myeloma cell)融合後形成融合瘤(Hybridoma),再從融合瘤細胞篩選出由單一細胞長出來(Single colony)能產生抗體對抗antigen的一群細胞如下圖
Monoclonal antibody production  
圖二Monoclonal antibody 的製造流程

Mouse monoclonal antibody
不適合用來做為Therapeutic antibody因為打進人體後人體會產生Anti-mouse IgG antibody其實Monoclonal antibody最重要的部分是與抗原結合的CDR(Complementary determinant region)如下圖CDR1/CDR2/CDR3
antibody_schematic  
圖三抗體的立體結構及CDR位置。CDR1=L1+H1; CDR2=L2+H2; CDR3=L3+H3。
L=Light chain; H=Heavy chain
欲製造Humanized antibody只要把Mouse hybridoma cell製造抗體的基因定序找出CDRs~Heavy chainLight chainCDR1/CDR2/CDR3cDNA片段(每一個CDR10~ amino acid, 相當於30~ base pairs in cDNA),並將六個CDR的DNA序列(A T C G)合成出來接進人類抗體基因(Human immunoglobulin genes)相對應的Heavy chainLight chain cDNA上的CDR1/CDR2/CDR3位置換句話說就是用小鼠抗體的CDR1/CDR2/CDR3 cDNA置換人類抗體的CDR1/CDR2/CDR3 cDNA(人類抗體的CDR1/CDR2/CDR3 cDNA被刪掉)經置換過的human IgG heavy chain cDNAhuman IgG light chain cDNA分別接在兩個Expression vectors如下圖
Production of humanized antibody    
圖四Humanized antibody的製造流程。紅藍黃三色標示Mouse hybridoma cell immunoglobulin heavy chain and light chain CDRs

如圖四Plasmid 1Plasmid 2 一起送進CHO cell (Chinese hamster ovary cell),然後用G418 (Neo) + Hygromycin (Hyg) 兩種抗生素篩選抗藥性的CHO cellG418會強迫Plasmid 1 進入CHO cell GenomeHygromycin會強迫Plasmid 2進入CHO cell Genome然後將CHO cells養成數百個Single colony,從中篩選會分泌抗體的Single colony (抗藥性的CHO cells)此處使用CHO cell來製造抗體,Plasmid 1及Plasmid 2 上有特殊Promoter可驅動Heavy chain及Light chain表現,因此不需要B cell或Hybridoma cell就能製造出大量且品質一致的抗體

Chimeric antibody
則是擷取Mouse monoclonal antibody中的 VL 及VHMouse VL-Human CL cDNA接起來,再把Mouse VH-Human CH cDNA接起來Mouse  VL 及VH包含CDR1/CDR2/CDR3,但這種Chimeric antibody擷取太多Mouse monoclonal antibody的成份如下圖
Chimeric antibody production    
圖五Chimeric antibody的製造流程與Humanized antibody類似

Human therapeutic antibody
怎麼做出來的有兩種方式
1.
將小鼠的抗體Heavy chain Light chain基因都Knockout然後把人類抗體Heavy chain Light chain基因植入小鼠的Genome再篩選適合製造Human monoclonal antibody的小鼠製造方式如圖二
2. Phage antibody display library
如下圖六,將人類抗體Fab fragment的兩段cDNA植入M13 Phage genomeHeavy chainLight chain各有三個CDR,若每個CDR10amino acid組成則每個CDR至少有2010種胺基酸組合Fab fragment有六個CDR因此有6 x 2010種胺基酸組合操作方式是以M13 phage genometemplate在CDRs進行隨機突變CDR胺基酸組合數代表Library的大小Library 越大越能篩到想要的抗體
Phage display method  
圖六人類抗體Fab fragment表現於HuCal phage (M13 phage的衍生Phage)

 Phage-display-technology   

圖七Phage antibody display
如上圖將抗原蛋白固定在試管壁Phage library通過試管後,把與抗原蛋白結合的Phage挑出來用E coli 培養,反覆篩選出與抗原結合力最強的Phage然後將Phage genome 上的兩個Fab cDNA(Light chain Heavy chain-Fab)切下來,其中Heavy chain-Fab接上Fc cDNA就是Full-length heavy chain cDNA有了Heavy chain Light chain cDNA就可用 "圖四" 的流程製造Human antibody今年諾貝爾化學獎其中之一就是發展出Phage display library的科學家 Gregory Winter 與 George Smith現在製造Therapeutic human antibody可以不使用動物及Hybridoma cell,只需Phage antibody library及Cell line (CHO cell, NS0 cell, Sp2/0 cell等),加上基本的分子生物學技術,就能製造Human antibody against a target antigen to achieve a presumed therapeutic effect. 


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