現在臨床上使用的治療性抗體(Therapeutic antibody)以Human及Humanized antibody為主，Mouse 及Chimeric antibody仍有但會被漸漸淘汰。1986年上市的anti-CD3 antibody (Muromonab-CD3)，用於對抗器官移植的排斥作用，是Mouse monoclonal antibody；1997年上市的anti-CD20 antibody (Rituximab)，用於治療 Non-Hodgkin's lymphoma，是Chimeric mouse-human antibody。1998年以後，美國FDA核准上市的Therapeutic antibody以Humanized antibody為主，現在的趨勢則是以Phage antibody library篩選Purely human antibody。
有醫學生問到「Humanized antibody」，到底Humanized antibody 與Human antibody是怎樣造成的差異？
關於Chimeric antibody, humanized antibody, human antibody 如果沒有好的生化基礎及分子生物的實戰經驗，絕對看不懂Textbook及Review article在寫些甚麼，卷哥卷姊恐怕也是讀天書，霧煞煞。
下圖顯示Therapeutic antibody的演變：
圖一：治療性抗體之演變，土黃色區域來自Mouse monoclonal antibody，藍色區域是Human antibody 的成份。
Mouse antibody 即Monoclonal antibody，是小鼠經抗原(antigen)刺激後，取出脾臟的淋巴細胞與骨髓瘤細胞(Myeloma cell)融合後，形成融合瘤(Hybridoma)，再從融合瘤細胞篩選出由單一細胞長出來(Single colony)能產生抗體對抗antigen的一群細胞，如下圖：
圖二：Monoclonal antibody 的製造流程
Mouse monoclonal antibody不適合用來做為Therapeutic antibody，因為打進人體後，人體會產生Anti-mouse IgG antibody。其實Monoclonal antibody最重要的部分是與抗原結合的CDR(Complementary determinant region)，如下圖CDR1/CDR2/CDR3：
圖三：抗體的立體結構及CDR位置。CDR1=L1+H1; CDR2=L2+H2; CDR3=L3+H3。
L=Light chain; H=Heavy chain
欲製造Humanized antibody，只要把Mouse hybridoma cell製造抗體的基因定序，找出CDRs~即Heavy chain及Light chain上CDR1/CDR2/CDR3的cDNA片段(每一個CDR約10~ amino acid, 相當於30~ base pairs in cDNA)，並將六個CDR的DNA序列(A T C G)合成出來，接進人類抗體基因(Human immunoglobulin genes)相對應的Heavy chain及Light chain cDNA上的CDR1/CDR2/CDR3位置，換句話說，就是用小鼠抗體的CDR1/CDR2/CDR3 cDNA置換人類抗體的CDR1/CDR2/CDR3 cDNA(人類抗體的CDR1/CDR2/CDR3 cDNA被刪掉)。經置換過的human IgG heavy chain cDNA與human IgG light chain cDNA，分別接在兩個Expression vectors，如下圖：
圖四：Humanized antibody的製造流程。紅藍黃三色標示Mouse hybridoma cell immunoglobulin heavy chain and light chain CDRs。
如圖四，將Plasmid 1與Plasmid 2 一起送進CHO cell (Chinese hamster ovary cell)，然後用G418 (Neo) + Hygromycin (Hyg) 兩種抗生素篩選抗藥性的CHO cell，G418會強迫Plasmid 1 進入CHO cell 的Genome，Hygromycin會強迫Plasmid 2進入CHO cell 的Genome。然後將CHO cells養成數百個Single colony，從中篩選會分泌抗體的Single colony (抗藥性的CHO cells)。此處使用CHO cell來製造抗體，Plasmid 1及Plasmid 2 上有特殊Promoter可驅動Heavy chain及Light chain表現，因此不需要B cell或Hybridoma cell就能製造出大量且品質一致的抗體。
Chimeric antibody則是擷取Mouse monoclonal antibody中的 VL 及VH，把Mouse VL-Human CL cDNA接起來，再把Mouse VH-Human CH cDNA接起來，Mouse VL 及VH包含CDR1/CDR2/CDR3，但這種Chimeric antibody擷取太多Mouse monoclonal antibody的成份，如下圖：
圖五：Chimeric antibody的製造流程與Humanized antibody類似
Human therapeutic antibody怎麼做出來的？有兩種方式：
1. 將小鼠的抗體Heavy chain 及Light chain基因都Knockout，然後把人類抗體Heavy chain 及Light chain基因植入小鼠的Genome，再篩選適合製造Human monoclonal antibody的小鼠，製造方式如圖二。
2. Phage antibody display library如下圖六，將人類抗體Fab fragment的兩段cDNA植入M13 Phage genome。Heavy chain與Light chain各有三個CDR，若每個CDR由10個amino acid組成，則每個CDR至少有2010種胺基酸組合，Fab fragment有六個CDR，因此有6 x 2010種胺基酸組合。操作方式是以M13 phage genome為template在CDRs進行隨機突變，CDR胺基酸組合數代表Library的大小，Library 越大，越能篩到想要的抗體：
圖六：人類抗體Fab fragment表現於HuCal phage (M13 phage的衍生Phage)
圖七：Phage antibody display。
如上圖，將抗原蛋白固定在試管壁，Phage library通過試管後，把與抗原蛋白結合的Phage挑出來用E coli 培養，反覆篩選出與抗原結合力最強的Phage，然後將Phage genome 上的兩個Fab cDNA(Light chain 及Heavy chain-Fab)切下來，其中Heavy chain-Fab接上Fc cDNA就是Full-length heavy chain cDNA。有了Heavy chain 及Light chain cDNA，就可用 "圖四" 的流程製造Human antibody。今年諾貝爾化學獎其中之一就是發展出Phage display library的科學家 Gregory Winter 與 George Smith。現在製造Therapeutic human antibody可以不使用動物及Hybridoma cell，只需Phage antibody library及Cell line (CHO cell, NS0 cell, Sp2/0 cell等)，加上基本的分子生物學技術，就能製造Human antibody against a target antigen to achieve a presumed therapeutic effect.
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