人生沒有用不到的經歷

1980年代Oncogene的研究模式：
1. 將Oncogene表現在NIH3T3 cell 或MEF cell (mouse embryonic fibroblast)，讓細胞轉型(Transform)。NIH3T3與MEF都是老鼠的細胞。
2. 將轉型的細胞種在裸鼠身上，會長成腫瘤。

Src是第一個Oncogene，但人類正常的c-Src無法讓NIH3T3 cell 或MEF cell轉型，必須要將Tyr530突變成其它胺基酸才能讓這些細胞轉型，問題是人類沒有這樣突變的c-Src！

如下圖，v-erbB1是Truncated EGFR，少了細胞膜外接收EGF的部分(Extracellular domain)。
 

v-erbB1是不受調控的Tyrosine kinase，如上圖，位於細胞膜內側(細胞質)的Kinase domain會把其它v-erbB1磷酸化(autophosphorylation)，這種Kinase-on的作用模式會不斷傳遞細胞生長的訊息，讓細胞轉型，但正常的EGFR (c-erbB1)要有EGF刺激才會有如下圖所示的autophosphorylation：
 
Receptor tyrosine kinase 接收Ligand之後會形成Dimer，然後Dimer之一會將對方磷酸化。

EGFR是個很大的蛋白(180kDa)，從1980到1990年代，沒有人用心去找EGFR Kinase-on的腫瘤突變，直到2004年才在肺癌病人的腫瘤組織中找到Kinase-on的突變(肺癌這樣的突變也只有10%)。在此以前，有一個假說，Oncogene在正常細胞是以Proto-oncogene的形式存在，突變後才會轉成Oncogene，這個假說基本沒錯，但在1980年代正常的c-Src與c-erbB1在腫瘤中都沒被找到Kinase-on的突變。那到底人類的腫瘤是甚麼樣的Proto-oncogene發生突變？下面有一個尋找人類Oncogene的實驗流程：
 

在人類腫瘤細胞DNA中混入帶有G418抗藥基因的Plasmid，NIH3T3 cells 吸收人類腫瘤細胞的DNA之後，可用G418篩選出抗藥性的Clones (抗藥基因會強迫NIH3T3 cells 進行基因重組，把抗藥基因插入NIH3T3 cells 的Genome，人類腫瘤的DNA片段也會順道插進去)。如果插進去的人類腫瘤DNA片段含有Oncogene，預期會使NIH3T3 cell轉型，如下圖：
 

如上圖，NIH3T3 cells變成腫瘤細胞了，那怎樣把人類的Oncogene從NIH3T3 cells找出來呢？簡單地說，NIH3T3 cells是老鼠細胞，與人類細胞的Genome仍有差別，人類的Genome中有Alu repeat，老鼠的Genome中沒有，利用這項差別，1982年人類的第一個Oncogene終於被找到，但仍脫離不了Retrovirus！
https://www.nature.com/articles/297474a0
找到Oncogene那一剎間，著實令科學家失望，一大群人三個研究團隊尋尋覓覓，大海撈針，找到的Oncogene竟然在實驗室的冰箱擺了好幾年，它是c-Harvey-Ras(c-Ha-Ras)，原本來自Harvey murine sarcoma virus，這病毒盜走了老鼠的c-Ha-Ras基因。人類的c-Ha-Ras基因不會讓NIH3T3 cell轉型，那v-Ha-Ras為何會引起老鼠的腫瘤呢？關鍵在病毒的Reverse transcriptase在複製DNA時沒有校正(Proof-reading)的功能，DNA做錯了就將錯就錯，因此在v-Ha-Ras會出現c-Ha-Ras沒有的突變。從腫瘤細胞分離出的DNA，送進NIH3T3 cell讓細胞轉型，最後得到的c-Ha-Ras與正常細胞的c-Ha-Ras有何不同？「突變」！如下圖：
 

讓NIH3T3 cell轉型成腫瘤的c-Ha-Ras，第12個胺基酸由Glycine(GGC)突變成Valine(GTC)，上圖codon顯示cDNA上只有一個鹼基發生突變 "由G變成T"，讓c-Ha-Ras從 "受調節性" 的活化，轉變成 "持續性" 的活化。

 
如上圖所示，持續性活化的Ras，不受上游EGF-EGFR訊息傳遞的調控，直接把細胞生長的訊息不斷往下傳遞，因而引發腫瘤。這是第一個Proto-oncogene，因突變而轉變成Oncogene的案例，其後Harvey-Ras與Kirsten-Ras很快就被發現在許多人類腫瘤有突變，Kirsten-Ras在胰臟癌的突變機率高達88%，在大腸癌的突變機率45%。Ras family有三個主要的Isoform：Harvey Ras (HRas)、Kirsten Ras (KRas)、NRas，在腫瘤中都有高比率的突變。

Ras 的下游Raf後來也被發現在人類腫瘤有Activating mutation，大腸癌BRaf的突變機率是10%，黑色素瘤BRaf的突變機率則是60% 。Raf 最早也是來自Retrovirus~~v-raf！