腫瘤生物寫到第14, 15回時出現兩個時髦的名詞
Homologous recombination (HR)
Homology-directed repair(HDR)
Non-homologous end joining(NHEJ)
這兩個名詞於2012年因CRISPR-Cas9紅了起來2012年以前醫學生可以不知道HDR/NHEJ2012年以後,如果你不想知道HDR/NHEJ,建議你不要來學醫。
CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeats
Cas: CRISPR-associated proteins

CRISPR-Cas9
源自細菌對噬菌體(Bacteriophage)的免疫觀念。台灣現在很少人在養噬菌體我們把時間推到1990年代當時l phage genome是實驗室中常用的cDNAGenomic DNACloning vector。養l phage需要一點技巧因為常會出現E. coli的免疫現象,就是當你把l phageE. coli混和在一塊兒養了半天,結果發現l phage產量少得可憐誰會想去研究E. coliAdaptive immunity如果1990年代你一頭栽進E. coliAdaptive immunity會找到CRISPR-Cas系統嗎答案是否定的E. coli沒有CRISPR-Cas,因為E. coliH-NS regulator會抑制CRISPR-Cas系統的形成CRISPR-Cas系統可算是某些細菌的Adaptive immunity但不要忘了Autoimmunity(自體免疫)的風險Cas endonuclease也可能切斷細菌的DNAE. coli顯然比較聰明它有更好的方式來產生Immunity against phage,因此拒絕了CRISPR-Cas進入它自己的Genome
https://www.nature.com/articles/nrmicro2315
Bacteriophage resistance mechanisms
這篇文章寫細菌如何對抗 phage值得一讀如果你無法Download版主可以寄給你

CRISPR-Cas
已不算新知識,但Lehninger第七版才有如果你想了解這系統的梗概今年一月的Scientific American有一篇文章也值得一讀
https://www.scientificamerican.com/article/5-big-mysteries-about-crisprs-origins/

crispr-graphic-ONLINE    
如上圖所示Phage(Virus)入侵細菌後細菌可能會盜取一段PhageDNA把它插進細菌自己的Genome你看上圖有一個CRISPR array裡面有各種PhageDNA片段(Spacers)當之前入侵的Phage再度入侵時細菌會用那段盜來DNA為模板合成RNAPhageDNA配對每種細菌有它自己的Cas endonucleaseDNA-RNA配對的特殊序列上切斷Phage DNA,這樣Phage就死了CRISPR-Cas有風險那段RNA既然能與Phage DNA配對當然也會回過頭來跟細菌自己CRISPR array上的DNA進行配對,因此Cas endonuclease也可能切斷細菌的Genome,引發Autoimmunity造成自我毀滅。所以,E. coli 就比較厲害,反而會用H-NS regulator剔除CRISPR array,因為E. coli有更好的免疫機制來對抗Phage入侵。

CRISPR-Cas9
來自Streptococcus pyogenes它的作用機制很特別
Gene-Editing  
如上圖Tracr RNACas9都是細菌的東西你只要在Tracr RNA後面接上人類Genomic DNA相對的RNA序列(Guide RNA),請注意DNA-RNA配對序列之前在Genomic DNA必須有PAM sequence(NGG),這樣Cas9就會在特定部位造成Double strand break
PAM: Protospacer adjacent motif
CRISPR-Cas9 design  
上圖是你想在細胞Genomic DNA上編輯的Target DNA sequence,紅色三角形是Cas9切割的部位(從NGG往前數三個鹼基)Target DNA sequence接進廠商設計好的Plasmid就可以操作Gene editing

Cas9 plasmid  
如上圖,Plasmid上有Cas9基因,你只要設計Target DNA sequence,接進如上的Plasmid,再將Plasmid送入細胞,細胞就會表現Cas9Guide RNA

CRISPR-Cas9-dual-method-1  
如上圖,細胞接收Plasmid後表現Cas9Guide RNAGenomic DNAGuide RNA配對後,Genomic DNACas9切斷,一個Double strand break會形成細胞有兩種方式修復Double strand break
1. HDR(Homology-directed recombination)
你只要給細胞一段Donor DNA(可在某個Plasmid上)上面有你想改變的DNA序列只要那段序列前後的DNA與斷裂點的Genomic DNA相同(Homology),細胞走到G2 phase時經過HDR就能把你想改變的DNA序列插進Strand breakHDR是隨機發生的斷裂的Genomic DNA也可能與另一股染色體進行HDR進行正常的修復
2. NHEJ
這種修復不精確常會插入(Insertion)或刪除(Deletion)幾個鹼基(Indel)而造成mRNAFrameshift基因就被Knockout(打死)

下一步是進行篩選方法很簡單可將細胞養成一個一個的clone,如下圖每個clone從一個細胞養成數千個細胞然後把細胞挑起來用PCRDNA sequencing篩選Gene editing成功的cloneCRISPR-Cas9來做Gene editing非常方便你只要買一個CRISPR-Cas9 plasmid就能輕易將基因做出你想要的改變(Knockout, mutation, insertion, deletion, etc)
single colony  
上圖顯示細胞的Clones,每個Clone都可挑出來養多,然後抽取DNA,做PCR,DNA定序,這樣就能找到你要的Target DNA sequence在Genomic DNA上所做的改變

CRISPR array有點像人類抗體基因的Vn-Dn-Jn乍看之下是細菌盜取了Phage的DNA片段,猶如細菌與病毒的抗原訊息藏在Vn-Dn-Jn之中歸根究底這是造物者的傑作DNA是由簡單的A T C G鹼基組成物種在大渾沌中形成各種生命的DNA本來就互相投影你沒去過非洲蠻荒之地但去了之後免疫基因自然會表現出來對抗你身旁從未接觸過的細菌重點是你在非洲很健康可能從未生病,換句話說你從未接觸那些細菌,但你對那些細菌先天有免疫力,藏在T cell  receptorVn-Dn-Jn之中


創作者介紹

人生沒有用不到的經歷

wleemc 發表在 痞客邦 PIXNET 留言(4) 人氣()


留言列表 (4)

發表留言
  • wleemc
  • HDR/HHEJ 這兩個名詞於2012年因CRISPR-Cas9紅了起來。2012年以前,醫學生可以不知道HDR/NHEJ,但2012年以後,如果你不想知道HDR/NHEJ,建議你不要來學醫。
  • 訪客
  • 這次大一普生就有考CRISPR
  • 訪客
  • 「半吊子醫生腦中只有共筆考古題,沒讀過醫學書,還自以為很懂,假裝和藹可親來欺騙民眾」

    就怕軍醫體系裡的贏家們光鮮亮麗,號稱某某所的教授,而當初多是念共筆畢業的。
  • 訪客
  • 版主新年快樂~