人生沒有用不到的經歷

新冠病毒疫情將如何演變？目前疫情分布圖可知美國的高加索白人及拉美人種死亡率最高。第二波疫情會如何發展？下圖可見端倪：
 
 

圖一：美國新冠肺炎每日新病例人數(上)及每日死亡人數(下)。Google「新冠 美國 死亡人數」會出現圖一(下)，縱座標更改成「新病例」即得圖一(上)。
6/13以前，每日新病例人數平穩，6/20出現一個新的高峰，6/26又一個高峰，7/3又一個高峰(當日增加57209例)。從圖一(下)可知，目前新病例一直累積，但每日死亡人數呈階梯狀下降(7月4日273人死亡)，未來一兩週如果每日死亡人數沒有隨圖一(上) 6/20、6/26、7/3的高峰增加，而是一直下降，代表新病例的高峰重症病例快速下降，美國人對新冠病毒正在產生群體免疫，若果真如此，川普的佛系防疫雖已造成13.2萬人死亡及數千萬人失業，更可能使他連任無望，但他撐住美國經濟，並以美國強大的經濟進行最符合自然法則的防疫。

 
圖二：新冠病毒Spike protein於今年四月初第614個胺基酸已由Aspartate (D)轉變成感染力較強的Glycine (G)為主。

 
圖三：今年四月初，美國疫情大爆發時，SARS-CoV-2 Spike protein就已轉換成G614 predominance，經過三個月，美國感染人數越來越多，但每日死亡人數越來越少。推測應該是G614 + 其它突變，使SARS-CoV-2的致病力越來越弱，至少美國的 "新病例數vs死亡人數" 的數據是這樣。

新冠病毒疫苗研發的主流是Adenovirus vector vaccine 與RNA vaccine。
Adenovirus vector vaccine：
Ad5-nCoV (CanSino Biologics -- 中國軍方)
AZD1222 (University of Oxford + Aztrazeneca -- 英國)

RNA vaccine：
mRNA-1273 (Moderna --美國)
BNT162 (Pfizer-BioNtech--美國)

無論Adenovirus vector vaccine或是RNA vaccine，目前都未在人類疫苗注射的名單中，新冠病毒疫情將使這兩類疫苗變成事實，臨床試驗的結果證實以上疫苗可在人體引發對抗新冠病毒的抗體。
最常用來製造疫苗的Adenovirus vector是E1-deleted，下面是Adenovirus genome簡圖：

   
圖四：Adenovirus genome與各個基因所製造出的蛋白(B)在病毒顆粒上的相對位置(A)。E1-deleted是把製造E1A與E1B的DNA序列刪除，新冠病毒的Spike protein cDNA可接在此處。基因的表現需要一段特別的DNA，稱為Promoter，如上圖Promoter-Spike protein cDNA。

中國軍方製造的Ad5-nCoV疫苗推測如上圖是E1-deleted + Promoter-Spike protein cDNA，疫苗(Adenovirus-spike protein)可經由噴霧噴進鼻腔，這種病毒(缺少E1A/E1B)進入呼吸道上皮細胞後除了會表現Spike protein之外，也能在細胞內進行病毒DNA複製(少量)，製造出少量的病毒顆粒，但不引發細胞死亡(即無Cytopathic effect)，模擬上呼吸道感染的輕症：
1. CD8⁺ T cell被病毒感染的細胞分泌的Cytokines (IL-1b, IL-6, IL-8, IL-18)吸引至感染處攻擊被感染的細胞。此時CD8⁺ T cell會分泌TNF-a及IFN-g，這兩種是更強的Cytokines
2. Dendritic cell也被Cytokines吸引過來吞入病毒碎片，然後爬進局部淋巴結，將外來抗原訊息傳給Naïve Th。Naïve Th分化成Th1, Th2, Tfh, Treg；Th2及Tfh刺激Naïve B cell活化，進一步分化產生抗體，並擁有記憶。

RNA vaccine的RNA genome通常會使用Self-amplifying RNA, 結構如下圖：

   
圖五：利用某種病毒如Alphavirus的Genome，截取Genome的一部分(Nonstructural genes與Subgenomic promoter)，Nonstructural genes製造出來的蛋白會形成Replication complex，可大量複製病毒的Structural genes (即RNA, 如上圖可置換成新冠病毒的Spike protein mRNA)。

RNA vaccine是Self-amplifying RNA 包在Lipid nanoparticle中，如下圖：

 
圖六：RNA-lipid nanoparticle(RNA-LNP)的結構圖。RNA帶負電荷，所以需要正電荷的Cationic lipid讓LNP呈電中性。Zwitterionic lipid，一頭帶正電荷，另一頭帶負電荷，用來填充達成電中性後不足的Lipid。PEGylated lipid是電中性的Lipid接上PEG(polyethylene glycol)，可增加水溶性，也可避免LNP聚集成一團。

如上的RNA lipid nanoparticle是用肌肉注射打進人體，RNA-LNP會進入肌肉細胞，但肌肉細胞已高度分化，正常情況下不會用MHC-I去呈現外來抗原，如果會，也蠻麻煩的，可能會把CD8⁺ T cell招過來攻擊肌肉細胞，嚴重時可能發生局部肌肉壞死。最好是組織中的Macrophage或Dendritic cell把RNA-LNP吞下去，在細胞質中製造Spike protein，然後進入局部淋巴結，將Spike protein抗原訊息傳遞給T cell，由於沒有感染發生，B cell的分化可能因Cytokines缺乏而力道不足，如下圖：

 
圖七：完整的抗體產生需要多種Cytokines作用於Tfh-B cell，B cell 再進入Germinal center進行Somatic hypermutation，Tfh也會促使B cell產生記憶。RNA-LNP是否能產生如此複雜的效應? 要碰運氣。

RNA-LNP打入人體後，可能進入各種細胞表現Spike protein，細胞老化死亡後Spike protein的碎片會釋出進入血液循環，被某幾個Clone的Naïve B cell胞膜上的IgM抓到而活化產生抗體，這些抗體主要來自B1b及Marginal zone B cell，當抗原消失後，抗體即停產。

美國1999年Adenovirus gene therapy 臨床試驗發生死亡事件，FDA遲遲不敢批准另一個Adenovirus的臨床試驗，因此美國藥廠(Moderna及Pfizer)的COVID-19疫苗都是RNA-LNP。下面有兩篇文章談及此事：
Virus treatment questioned after gene therapy death
https://www.nature.com/articles/43977

The Death of Jesse Gelsinger, 20 Years Later 
https://www.sciencehistory.org/distillations/the-death-of-jesse-gelsinger-20-years-later

新冠病毒來勢洶洶，傳統疫苗(Peptide vaccine, peptide subunit vaccine, live  attenuated vaccine, inactivated vaccine) 發展速度極慢，於是中國與英國發展Adenovirus vector vaccine，美國發展RNA-LNP，台灣也想湊一腳，以免被說沒做事，醞釀了好一陣子，7/1終於有了眉目，國衛院宣布發展層次較低的DNA vaccine，有做過分生實驗的人都會做，就是把Spike protein cDNA接進一個Expression vector (plasmid)，然後用E.coli去大量繁殖Plasmid。Plasmid純化出來後包進Lipid nanoparticle就是疫苗，如下圖所示：

 
圖八：疫苗用的Expression vector越簡單越好，Spike protein cDNA插在MCS (multiple cloning sites)，用CMV promoter驅動Spike protein mRNA表現。

   
圖九：DNA/RNA-LNP (Helper lipid即圖六的Zwitterionic lipid)。Lipid nanoparticle可包裹Plasmid DNA做DNA vaccine，也可包裹RNA做RNA vaccine。

DNA-LNP必須進入細胞核才會製造Spike protein mRNA然後在細胞質ER(Endoplasmic reticulum)表現出Spike protein，誘發抗體的路徑與RNA-LNP類似，即經由Dendritic cell引發T cell immunity (可能很弱或根本不會發生)，或是單純在各種細胞表現，細胞老化死亡釋出Spike protein碎片，被Naïve B cell的IgM抓到而活化產生抗體。

https://health.udn.com/health/story/120952/4672074
國衛院今天(7/1)也宣布將攜手生技業者，以DNA疫苗做為開發主軸，最快年底前進入臨床試驗，明年下半年可望問世。