人生沒有用不到的經歷

Oncogene的研究，從1911年發現Rous sarcoma virus(RSV)，直到1970年才從RSV找到Reverse transcriptase(RT)。因為有RSV才有RT；有RT將RSV的RNA genome轉成DNA，Oncogene才會被發現。與Oncogene研究的同時，1971年Alfred Knudson研究Retinoblastoma提出了Two-hit hypothesis的觀念。Retinoblastoma是第13對染色體先天有缺失(Deletion)或突變(Mutation)，如下圖：
 
大部分Retinoblastoma病童(圖右)的第13對染色體q14，其中之一有缺失(圖左)，但只要另一條染色體正常，不會發病(病童的右眼)。

Knudson的Two-hit hypothesis如下圖所示，為腫瘤的發生提供了重要的觀念：
 

對Retinoblastoma而言，最常見的情況是病童第13對染色體 "其中之一" 的q14先天有缺陷，在視網膜細胞分裂時，”某個” 視網膜細胞第13對染色體另一條的q14又「隨機」發生deletion or mutation(如上圖b)。Knudson的Two-hit hypothesis預測Tumor suppressor gene~Rb的存在，這種基因會抑制腫瘤的發生。第13對染色體的q14到底有甚麼重要的基因(當時稱之為Rb)，當兩股染色體上的Rb基因都有缺陷時會讓視網膜細胞癌化？

Retinoblastoma是個古老的兒童眼睛腫瘤，1970年染色體Q banding發展出來，在顯微鏡下清楚看到第13對染色體染色體的缺失，那是一段DNA。Knudson的Two-hit hypothesis預知Tumor suppressor gene的存在，那段DNA(Rb gene)因此熱門起來，許多人想找到那段缺陷的基因(Rb)，但都陷入大海撈針的困境，因為一段染色體的缺失是 "數百萬到數千萬個" 如A-T-C-G的鹼基。

 

不知從何時開始，病理醫師觀察患有Retinoblastoma病人的各項檢體組織，發現做Esterase染色時顏色常會比較淡，經過一段時間的經驗累積，Esterase D與Rb便被聯想在一塊兒~~兩個基因可能彼此緊鄰，只要在Genomic DNA library找到Esterase D基因，Rb可能就在它旁邊 (但這有點異想天開，哪有這麼湊巧的事兒)。Rb只是一個功能未知的DNA序列，但Esterase D是一種「酶」可與Substrate反應後藉 “顯色” 偵測其活性。Lehninger第六章在講Michaelis-Menten kinetics，這是醫學的基礎。要純化Esterase D，就要找適當的Substrate去偵測它：

 

上圖的Substrate與Esterase D反應後，會產生發光的化合物Umbelliferone，如此就能在蛋白純化過程中偵測Esterase D。Esterase D被純化出來，然後製備抗體(against Esterase D)，用抗體去Screen genomic DNA library：

   
1. 人類的Genomic DNA被切成片段後，與l Phage的genome接起來，用l Phage感染 E. coli ，複製各段人類的DNA。
2. l Phage會在培養皿上的E. coli 草叢上形成一個一個的Plaque，l Phage上的人類基因也會在Plaque表現出來(蛋白)。
3. 將Plaque轉至Nitrocellulous filter。
4. anti-Esterase D antibody可偵測 l Phage表現出來的Esterase D (在Nitrocellulours filter上)。

Esterase D的抗體是個Lucky probe，Esterase D基因被找到，Rb就在它旁邊！

Rb 的功能為何？
   
如上圖的Cell cycle，Rb與E2F在Go phase緊緊結合，已分化的細胞都在Go phase，當小孩的視網膜細胞準備進入G1 phase，DNA要複製前，Rb會被磷酸化而與E2F分開，於是E2F就會釋出與DP1形成Dimer，在染色體上與各種基因的Promoter結合，促進S phase蛋白的製造。如果沒有Rb扣住E2F，E2F便會不斷促進S phase蛋白的製造，視網膜細胞就無法回到Go phase，Retinoblastoma(腫瘤)因此形成。不僅視網膜細胞的Cell cycle如此運作，人體所有細胞更新分裂時，也是如此運作。Rb於1986年被找到，當時版主是大五醫學生，Robbins病理學沒有Rb基因，現在的大五醫學生如果不知道Rb基因，你該思考自己是否適合學醫。