學弟們好像有被安排進老師的實驗室,有一位學弟提到Genomic DNA 之純化,很多人不曉得其中的 tricks,實驗常失敗,下面是我的經驗:

如果你用 Commercial kit 去純化,要注意細胞 (白血球) 數目不宜過多。

純化的原理是用1% SDS (in TE buffer) 將細胞溶解,然後加 Proteinase K分解 DNA-binding proteinsProteinase K 要作用overnight。另外要加 RNase A 分解 RNA

此時你要注意,Proteinase K 常常無法 將 DNA-binding proteins完全分解,但你很難確知 DNA-binding proteins是否真的完全分解!

下一步是 Phenol/chloroform 萃取,注意把 Sample 分成兩管,一管 1/3 另一管 2/3,只萃取 1/3 那一管 (萃取是除去蛋白質碎片)

離心之後,只吸取上清液 上面3/4”,下面 1/4 沒把握就不要吸,Interface 很髒勿碰。當你吸取上清液時,如果有東西自 Interface Tip 拉上來,那就是DNA 與 DNA-binding proteins ,這很麻煩,代表 DNA-binding proteins 沒被完全分解。你必須再去離心一次,然後只吸取上面 1/2,其他忍痛丟掉

萃取兩次之後,加 0.1 volume 3M NaOAc pH5.2 1 volume Isopropanol 充分混合後離心將 DNA 沉澱下來。

如果你的下一步實驗 (例如 PCR) 做不出來,很可能是DNA的品質有問題,多半是上述 “Proteinase K 沒DNA-binding proteins 完全分解 DNA 的品質不好無法挽回,因為 DNA proteins 一起沉澱後就分不開。此時別緊張,你還有 2/3 Sample,再加一點 Proteinase K,設法讓 DNA-binding proteins 完全分解。接下來拿一半Sample 去做 Phenol/chloroform 萃取,重覆上面的離心與沉澱。

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  • andy20366
  • 內文:如果你用 Commercial kit 去純化,要注意細胞 (白血球) 數目不宜過多。

    可是學長要做PCR不就是要BUFFY COAT越多越好嗎?
  • 你收集到Buffy coat 之後,要用低張溶液將紅血球脹破,然後離心,白血球也
    會脹破集成一團,然後你可以再用低張溶液將那團白血球清洗一下。此時的沉澱
    物中有非常多的蛋白質,Buffy coat 越多,蛋白質也會越多,如果超Commercial
    kit 那 ~ml 裏面Proteinase K 的負荷,蛋白質就無法切割完全而影響 genomic
    DNA 之品質。好的 Genomic DNA 只要 1 ug 就可以做PCR,得到漂亮的結
    果。

    總之, Buffy coat 的量不能超過 Proteinase K 的負荷,否則,最後沉澱下來的
    Genomic DNA 會夾雜蛋白質而難溶於 TE buffer 或 水中。

    wleemc 於 2011/08/20 22:06 回覆

  • Weiwei
  • wleemc你好:
    最近在實驗上遇到PCR都P不出結果的情況,
    考慮了數種原因,其中就是genomic DNA的品質。
    看了你的文章受益良多。原來gDNA的品質影響盛大,
    不能只倉促用260/280跟260/230就評斷好壞。

    Good tricks !
  • 沒想到我的小 trick 能幫你解決問題, 祝你順利!

    wleemc 於 2012/05/26 10:13 回覆