人生沒有用不到的經歷

如果只要知道病毒的基因型，定序數百個鹼基即可，用傳統的Dideoxyribonucleotide chain termination(Sanger sequencing)方法，花費約台幣500-1000元。次世代DNA定序(Next-generation sequencing，NGS)可快速把人類細胞DNA的32億個鹼基(A T C G)在一兩天就定序出來，目前用於癌細胞全基因定序，可找出突變的基因，看病人的癌細胞突變是否符合現有的標靶藥物治療。NGS的花費在5-10萬台幣。

NGS的第一步是處理Genomic DNA。Genomic DNA的純化可使用現成的Genomic DNA purification kit，接下來的步驟在Youtube有許多影片，版主選一則來說明：
https://www.youtube.com/watch?v=CZeN-IgjYCo
影片中，Genomic DNA要切成小片段(DNA fragmentation)，然後接上Adaptor(double-strand oligonucleotides)--->即Tagmentation，如下圖：
 
Genomic DNA fragmentation最好的方式是用Nextera XT transposome來完成，並同時接上Adaptor DNA，每一條Fragmented DNA約300~ base pairs (bp)，如下圖：
 
https://hahana.soest.hawaii.edu/cmoreserver/summercourse/2015/documents/Metagenomics_06-22/nextera_xt_sample_preparation_guide_15031942_c.pdf

 
利用DNA雙股配對，Single-strand adaptor oligonucleotides可將Adaptor-tagged fragmented DNA固定在影片中的Plate(DNA chip)上(如上圖)，在Plate上做「DNA amplification by PCR」及「Sequencing by DNA synthesis」，如下圖：
 
在Plate上進行DNA amplification by PCR(即DNA合成)，請觀看影片。

   
在Plate上用螢光標示的dA dT dC dG 合成DNA(Primer sequence即在Adaptor上)，每加入一個dNTP，就有一個螢光化物釋放出來被Detector偵測到。

人類染色體Genomic DNA由3.2 x 10⁸對鹼基(base pair, bp)組成，約6 pg(picogram)。Transposome可將Genomic DNA切成約300~ bp的DNA，因此每個細胞約有10⁶條(種)Fragmented DNA參與影片中的PCR + Sequencing。通常有約150-200個細胞(1-1.5 ng)的Genomic DNA參與全基因定序。

影片中的Plate可視作DNA chip，如果用1-1.5 ng的Genomic DNA去做定序，經過30個Cycle PCR就有「200個細胞」 x 「10⁶種Fragment DNA」 x 「10⁹ DNA synthesis by PCR」= 2 x 10¹⁷條300~bp DNA在Chip上。應用在人類全基因定序的每一片Chip上必須能接上2 x 10¹⁷以上的Single-strand oligonucleotides(Adaptor)。每條PCR-amplified DNA的定序反應(DNA synthesis)由一個顯微的Detector接收A T C G訊息(約200個細胞的Genomic DNA的集合)。每個細胞的Genomic DNA被Transposome隨機打斷，因此A T C G的DNA長鏈訊息會出現200種重疊，電腦程式再依據重疊的部位拼湊出整條染色體的ATCG序列。