1980年代Oncogene的研究模式:
1.
Oncogene表現在NIH3T3 cell MEF cell (mouse embryonic fibroblast),讓細胞轉型(Transform)NIH3T3與MEF都是老鼠的細胞
2.
將轉型的細胞種在裸鼠身上,會長成腫瘤。

Src
是第一個Oncogene,但人類正常的c-Src無法讓NIH3T3 cell MEF cell轉型,必須要將Tyr530突變成其它胺基酸才能讓這些細胞轉型,問題是人類沒有這樣突變的c-Src

如下圖,v-erbB1Truncated EGFR,少了細胞膜外接收EGF的部分(Extracellular domain)
ErbB1  

v-erbB1是不受調控的Tyrosine kinase,如上圖
位於細胞膜內側(細胞質)的Kinase domain會把其它v-erbB1磷酸化(autophosphorylation),這種Kinase-on的作用模式會不斷傳遞細胞生長的訊息,讓細胞轉型,但正常的EGFR (c-erbB1)要有EGF刺激才會有如下圖所示的autophosphorylation
EGFR dimerization  
Receptor tyrosine kinase
接收Ligand之後會形成Dimer,然後Dimer之一會將對方磷酸化。

EGFR是個很大的蛋白(180kDa)
19801990年代,沒有人用心去找EGFR Kinase-on的腫瘤突變,直到2004年才在肺癌病人的腫瘤組織中找到Kinase-on的突變(肺癌這樣的突變也只有10%)。在此以前,有一個假說,Oncogene在正常細胞是以Proto-oncogene的形式存在,突變後才會轉成Oncogene,這個假說基本沒錯,但在1980年代正常的c-Srcc-erbB1在腫瘤中都沒被找到Kinase-on的突變。那到底人類的腫瘤是甚麼樣的Proto-oncogene發生突變?下面有一個尋找人類Oncogene的實驗流程:
Oncogene cloning  

在人類腫瘤細胞DNA中混入帶有G418抗藥基因的PlasmidNIH3T3 cells 吸收人類腫瘤細胞的DNA之後,可用G418篩選出抗藥性的Clones (抗藥基因會強迫NIH3T3 cells 進行基因重組,把抗藥基因插入NIH3T3 cells Genome,人類腫瘤的DNA片段也會順道插進去)。如果插進去的人類腫瘤DNA片段含有Oncogene,預期會使NIH3T3 cell轉型,如下圖:
focus forming1  

如上圖NIH3T3 cells
變成腫瘤細胞了,那怎樣把人類的OncogeneNIH3T3 cells找出來呢?簡單地說,NIH3T3 cells是老鼠細胞,與人類細胞的Genome仍有差別,人類的Genome中有Alu repeat,老鼠的Genome中沒有,利用這項差別,1982年人類的第一個Oncogene終於被找到,但仍脫離不了Retrovirus
https://www.nature.com/articles/297474a0
找到Oncogene那一剎間,著實令科學家失望,一大群人三個研究團隊尋尋覓覓,大海撈針,找到的Oncogene竟然在實驗室的冰箱擺了好幾年,它是c-Harvey-Ras(c-Ha-Ras),原本來自Harvey murine sarcoma virus,這病毒盜走了老鼠的c-Ha-Ras基因。人類的c-Ha-Ras基因不會讓NIH3T3 cell轉型,那v-Ha-Ras為何會引起老鼠的腫瘤呢?關鍵在病毒的Reverse transcriptase在複製DNA時沒有校正(Proof-reading)的功能,DNA做錯了就將錯就錯,因此在v-Ha-Ras會出現c-Ha-Ras沒有的突變。從腫瘤細胞分離出的DNA,送進NIH3T3 cell讓細胞轉型,最後得到的c-Ha-Ras與正常細胞的c-Ha-Ras有何不同?「突變」!如下圖:
c-Ha-Ras  

NIH3T3 cell轉型成腫瘤的c-Ha-Ras,第12個胺基酸由Glycine(GGC)突變成Valine(GTC),上圖codon顯示cDNA上只有一個鹼基發生突變 "由G變成T",讓c-Ha-Ras從 "受調節性" 的活化,轉變成 "持續性" 的活化。

Map kinase pathway  
如上圖所示,持續性活化的Ras,不受上游EGF-EGFR訊息傳遞的調控,直接把細胞生長的訊息不斷往下傳遞,因而引發腫瘤。這是第一個Proto-oncogene因突變而轉變成Oncogene的案例,其後Harvey-RasKirsten-Ras很快就被發現在許多人類腫瘤有突變,Kirsten-Ras在胰臟癌的突變機率高達88%,在大腸癌的突變機率45%Ras family有三個主要的IsoformHarvey Ras (HRas)Kirsten Ras (KRas)NRas,在腫瘤中都有高比率的突變。

Ras
的下游Raf後來也被發現在人類腫瘤有Activating mutation,大腸癌BRaf的突變機率是10%,黑色素瘤BRaf的突變機率則是60% Raf 最早也是來自Retrovirus~~v-raf



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